(The effectiveness of Pseudomonas fluorescens RH4003 to control the bacterial wilt disease on some tomato varieties)
ABSTRAK
Varietas tanaman dapat mempengaruhi jumlah dan jenis mikroorganisme serta perbedaan dalam tingkat penekanan penyakit pada agens biokontrol tertentu. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh varietas tomat terhadap
keefektifan P. fluorescens RH4003 dalam menekan keparahan penyakit layu
bakteri, mengetahui kemampuan P. fluorescens RH4003 dalam menginduksi
aktivitas enzim peroksidase pada beberapa varietas tomat dan untuk mengetahui
pengaruh varietas tomat terhadap kemampuan P. fluorescens RH4003
mengkolonisasi rizosfer. Enam varietas tomat diuji pengaruhnya terhadap
keefektifan Pseudomonas fluorescens RH4003 dalam mengendalikan penyakit
layu bakteri. Diantara keenam varietas tersebut, Money Maker dan San Marzano
nyata lebih rentan dibandingkan dengan TM39 dan Ratna. Aplikasi P. fluorescens
RH4003 melalui penyiraman tanah dengan suspensi agens biokontrol di rumah kaca dapat menekan keparahan penyakit pada Money Maker dan San Marzano hingga 39%. Aktivitas enzim peroksidase setelah perendaman akar bibit dalam
suspensi P. fluorescens RH4003 paling tinggi terjadi pada varietas Money Maker
dan paling rendah pada TM39. Total koloni P. fluorescens RH4003 yang berhasil
diisolasi dari perakaran tomat lebih tinggi dibandingkan dengan dari tanah rizosfer. Total koloni yang berhasil diisolasi dari perakaran tomat varietas Ratna relatif lebih tinggi dibandingkan dari varietas tomat lainnya.
Kata kunci: peroksidase, Pseudomonas fluorescens, varietas tomat
ABSTRACT
Plant varieties could affect the kind and population of microorganisms and also the differences of disease suppression of certain biocontrol agent. These experiments were conducted to study the effects of tomato varieties to the
effectiveness of P. fluorescens RH4003 to suppress the bacterial wilt disease
severity, to study the ability of P. fluorescens RH4003 to induce peroxidase
activity in some tomato varieties and to study the effects of tomato varieties on
rhizosphere colonization by P. fluorescens RH4003. Six tomato varieties were
tested for their response on the effectiveness of Pseudomonas fluorescens
RH4003 to control bacterial wilt disease. Among them, Money Maker and San Marzano were relatively susceptible while TM39 and Ratna were relatively
73 biocontrol suspension into the soil was able to reduce the disease index on Money Maker and San Marzano up to 39%. The biocontrol agent induced the activity of
peroxidase differently on each variety. Highest induction was achieved when P.
fluorescens RH4003 applied on the root of Money Maker, while the lowest
induction was on TM39 treatment. Total colonies of P. fluorescens RH4003
isolated from the tomato rootlets were greater than that from the rhizosphere soil.
Total colonies of P. fluorescens RH4003 isolated from the root of Ratna variety
were relatively greater than on the other tomato varieties.
Keywords: peroxidase, Pseudomonas fluorescens, tomato varieties
PENDAHULUAN
Varietas tanaman dapat mempengaruhi jumlah dan jenis mikroorganisme (Smith & Goodman 1999). Komposisi mikroba dan kelimpahan spesies pada tanah yang berdekatan dengan tanaman berhubungan secara langsung maupun tidak langsung dengan eksudat akar dan beragam tergantung pada faktor
lingkungan yang sama yang mempengaruhi eksudasi ( Brimecombe et al. 2001).
Varietas tanaman juga dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba tertentu.
Simon et al. (2001) menyatakan bahwa galur tomat yang memiliki daya dukung
rendah (RIL 85) terhadap B. cereus UW85 juga rendah terhadap strain Bacillus
cereus yang lain, sedangkan RIL52 yang memiliki daya dukung tinggi terhadap B. cereus UW85 juga tinggi terhadap strain lain. Antar galur tidak berpengaruh nyata terhadap populasi awal UW85 tetapi berpengaruh nyata terhadap populasi awal
antar strain B. cereus.
Beberapa laporan menyebutkan bahwa diantara kultivar terdapat perbedaan dalam tingkat penekanan penyakit pada agens biokontrol tertentu (King
& Parke 1993; Liu et al. 1995; Smith et al. 1997). Liu et al. (1995) menemukan
adanya kekhususan kultivar untuk induksi ketahanan terhadap antraknosa pada mentimun oleh strain-strain PGPR. Varietas inang juga dapat mempengaruhi
ekspresi gen phlA, penyandi biosintesis 2,4-diacetylphloroglucinol (Notz et al.
2001).
Varietas tanaman yang berbeda akan menghasilkan pola eksudat yang berbeda sehingga kemungkinan dapat dilakukan perubahan terhadap organisme
Varietas tanaman yang tahan terhadap penyakit layu bakteri diharapkan menghasilkan eksudat akar dengan kandungan senyawa yang dibutuhkan oleh agens biokontrol sehingga akan menarik agens biokontrol untuk mengkolonisasi perakaran dan memproduksi senyawa antibiotik secara maksimal.
Penelitian ini dilakukan untuk : 1) mengetahui pengaruh varietas tomat
terhadap keefektifan P. fluorescens RH4003 dalam menekan keparahan penyakit
layu bakteri, 2) mengetahui kemampuan P. fluorescens RH4003 menginduksi
aktivitas enzim peroksidase pada beberapa varietas tomat, dan 3) mengetahui
pengaruh varietas tomat terhadap kemampuan P.fluorescens RH4003
mengkolonisasi rizosfer.
BAHAN DAN METODE
Isolat bakteri dan benih tomat
Isolat bakteri P. fluorescens RH4003 yang digunakan dalam percobaan ini
terdiri dari isolat liar dan mutan spontan yang tahan rifampisin 100 µg/ml. Mutan
diperoleh dengan cara menumbuhkan 0.1 ml, 108-109 cfu/ml suspensi bakteri
pada media King’s B agar yang mengandung rifampisin 100 µg/ml. Koloni yang tumbuh terpisah kemudian dipindahkan ke cawan agar baru yang juga mengandung rifampisin 100 µg/ml.
Lima varietas tomat yang digunakan merupakan jenis yang banyak dijual dipasaran, yaitu: Arthaloka, TM39, Ratna, San Marzano, dan Money Maker sedangkan satu jenis yang lain yaitu AVRDC L390 diperoleh dari AVRDC-Taiwan. AVRDC L390 termasuk varietas yang rentan (Jaunet dan Wang 1998). Ratna merupakan varietas tahan (Jaya 1997), sedangkan Arthaloka bersifat toleran terhadap penyakit layu bakteri (EWSI 2005).
Keefektifan P. fluorescens RH4003 terhadap layu bakteri pada beberapa varietas tomat
Bibit tomat dari masing-masing varietas yang sudah berumur 14 hari setelah tanam (hst) dipindahkan dari pot pembibitan ke polybag berdiameter 15 cm yang berisi tanah dan kompos dengan perbandingan 1:3. Tanah tersebut sudah
75
mengandung Ralstonia solanacearum dengan konsentrasi 107-108 cfu/g berat
basah tanah. Bibit yang sudah ditanam kemudian diberi perlakuan agens
biokontrol dengan cara menyiramkan suspensi P. fluorescens RH4003 dengan
kerapatan 108-109 cfu/ml sebanyak 100 ml per tanaman. Sebagai kontrol, tanaman
disiram dengan aquadest. Tiap-tiap perlakuan terdiri dari lima tanaman dan masing-masing diulang dua kali. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Faktorial Acak Kelompok dengan kelompok sebagai ulangan. Faktor pertama adalah varietas tanaman yang terdiri dari 6 taraf, yaitu: Arthaloka, TM39, Ratna, San Marzano, Money Maker dan AVRDC L390. Faktor kedua adalah agens biokontrol yang terdiri dari dua taraf, yaitu: aplikasi agens biokontrol dan tanpa aplikasi agens biokontrol. Kombinasi perlakuan yang diuji adalah: 1) Arthaloka tanpa biokontrol, 2) Arthaloka dengan biokontrol, 3) TM39 tanpa biokontrol, 4) TM39 dengan biokontrol, 5) Ratna tanpa biokontrol, 6) Ratna dengan biokontrol, 7) San Marzano tanpa biokontrol, 8) San Marzano dengan biokontrol, 9) Money Maker tanpa biokontrol, 10) Money Maker dengan biokontrol, 11) AVRDC L390 tanpa biokontrol, dan 12) AVRDC L390 dengan biokontrol. Keparahan penyakit dihitung menggunakan rumus Townsend dan Heuberger (Unterstenhofer 1963). Rumus keparahan penyakit adalah :
5
∑ ni x vi
i=0
Keparahan penyakit (%) = x 100% N x Z
ni = jumlah tanaman dengan skala penyakit ke-i vi = skala penyakit ke-i
N = Jumlah tanaman pada tiap perlakuan Z = Skala penyakit tertinggi
Rumus index penekanan penyakit:
DIc – DIb
Indeks penekanan penyakit = x 100%
Dic
DIc = Index penyakit pada kontrol
DIb = index penyakit pada perlakuan agens biokontrol
Kriteria penyakit dihitung menggunakan skala yang disebutkan oleh
1 = 0 < kelayuan daun ≤ 10%, 2 = 10 < kelayuan daun ≤ 30%, 3 = 30 , kelayuan
daun ≤ 60%, 4 = 60 < kelayuan daun ≤ 90%, dan 5 = 90 < kelayuan daun ≤ 100%.
Pengaruh varietas tomat terhadap populasi agens biokontrol
Benih tomat ditanam dalam pot plastik berukuran 5 x 5 x 5 cm yang berisi tanah tidak steril, tiap-tiap pot ditanami dua benih. Satu minggu setelah tanam,
bibit disiram dengan suspensi P. fluorescens RH4003 rifr sebanyak 10 ml dengan
kerapatan 108-109 cfu/ml. Setiap hari tanaman disiram dengan 50-100 ml air.
Setiap minggu setelah perlakuan, tiga tanaman dari masing-masing varietas dicabut dan tanah yang menempel pada perakaran dibersihkan. Akar yang sudah terbebas dari tanah kemudian dipotong pada leher akar, ditimbang berat basahnya dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 50 ml aquadest steril. Erlenmeyer dikocok dengan kecepatan 150 rpm selama 5 menit. Setelah dilakukan pengenceran berseri, 100 µl suspensi disebar dalam cawan berisi media King’s B yang mengandung rifampisin 100 µg/ml. Koloni bakteri yang tumbuh
dihitung setelah inkubasi 24 – 48 jam pada suhu kurang lebih 28oC.
Selain akar, sample juga diambil dari tanah bekas perakaran. Sebanyak 5 g tanah disuspensikan dalam 50 ml aquadest steril dan dikocok menggunakan “shaker” dengan kecepatan 150 rpm selama 5 menit. Langkah selanjutnya sama seperti langkah-langkah pada akar. Percobaan dilakukan sebanyak dua kali.
Pengaruh P. fluorescens RH4003 terhadap aktivitas enzim peroksidase
Perakaran bibit tomat yang berumur 14 hst disiram dengan suspensi agens
biokontrol sebanyak 10 ml per tanaman dengan kerapatan 108-109 cfu/ml. Satu
minggu setelah perlakuan, masing-masing tanaman dicabut dan dilakukan pengukuran aktifitas enzim peroksidase pada akar dan batang. Percobaan dilakukan sebanyak dua kali.
Akar dan batang dari tiga tanaman dipotong sepanjang 2 cm dan ditimbang berat basahnya, kemudian dihancurkan dengan mortar dalam 0,01M buffer fosfat pH 6,0 dengan perbandingan (akar + batang) : buffer = 1: 4. Hasil hancuran disaring dengan kertas saring whatman dan disentrifugasi selama 30 menit dengan
77 sebagai sediaan enzim. Semua pekerjaan dilakukan dalam kondisi dingin (suhu < 5oC).
Sebelum melakukan pengamatan aktivitas enzim, terlebih dahulu dibuat larutan pirogalol yang terdiri dari 10 ml pirogalol 0,5 M ditambah 12,5 ml buffer fosfat 0,066 M pH6,0. Selanjutnya larutan diencerkan dengan aquades sampai volumenya menjadi 100 ml. Sediaan enzim diencerkan dengan buffer fosfat 0,01 M pH 6,0 sehingga memiliki perbandingan 1: 3 dan dibuat homogen.
Pengamatan aktivitas enzim dilakukan dengan cara menambahkan 0,2 ml sediaan enzim yang telah diencerkan pada pereaksi yang terdiri dari 5 ml larutan
pirogalol 0,5 M dan 0,5 ml H2O2 1% di dalam kuvet. Campuran tersebut dibuat
homogen selama 5 hingga 10 detik dan diamati nilai absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm. Nilai absorbansi diamati setiap 30 detik selama 150 detik. Apabila nilai absorbansi terlalu tinggi maka perlu dilakukan pengenceran terhadap sediaan enzim dengan buffer fosfat. Unit Aktivitas Enzim (UAE) dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
Δ OD x sediaan enzim (ml) UAE = Bobot basah contoh (g)
Δ OD = nilai absorban rata-rata (b) dari satu pengamatan dicari
dengan menggunakan persamaan regresi y = a + bx; nilai absorbansi yang diperoleh terlebih dahulu dikurangi dengan blanko
HASIL DAN PEMBAHASAN