PENELITIAN I : OPTIMASI DAN MODIFIKAS
HASIL DAN PEMBAHASAN
3. Menggunakan N 2 Cair
Gambar 4. Profil Genom DNA Menggunakan N2
Keterangan : (1) B1*, (2) B2, (3) B3, (4) B4, (5) B5, (6) B6*, (7) B7*, (8) B8* (9) B9*, (10) B10* Cair yang Diuji melalui Gel Agarose B = Batangtoru
* = DNA Smear
Pola pita yang dihasilkan pada metode menggunakan N2 cair cukup baik, dari 10 pohon yang digunakan diperoleh 6 pohon untuk dianalisis pada tahap selanjutnya dengan pita DNA yang smear seperti terlihat pada Gambar 4.
Dari 3 metode modifikasi untuk optimasi diperoleh pola pita PCR yang dapat dikenali/skoring, dapat dilihat pada Gambar 5 berikut ini :
1500 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
Gambar 5. Propil Pita DNA dari Ketiga Metode Modifikasi Optimasi dengan Menggunakan Primer OPD-12 Keterangan : (1) S3, (2) S6, (3) G1/Pasir Kuarsa, (4) G3 Pasir Kuarsa, (5) M2A/Pasir Kuarsa, (6) NR1, (7) S2, (8)
P3, (9) P7, (10) G0/Pasir Kuarsa, (11) MIA, (12) B7/Nitrogen Cair, (13) B1/Nitrogen Cair, (14) B9/Nitrogen Cair, (15) B10/Nitrogen Cair, (16) M = 100 bp DNA Ladder
Pembahasan
Berbagai teknik atau metode dapat dilakukan untuk mengisolasi DNA tergantung dari jenis tanaman yang digunakan. Tetapi pada dasarnya ada tiga faktor penentu dalam ektraksi dan purifikasi DNA secara optimal : 1) penghomogenan jaringan tanaman, 2) komposisi penambahan larutan buffer pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel dan 3) penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnya untuk tanaman tahunan. DNA tanaman dengan kualitas rendah akan menyebabkan hasil amplifikasi fragmen DNA tidak optimum. Oleh sebab itu modifikasi pada metode ekstraksi yang sudah baku pada tanaman perlu dilakukan.
Stok DNA yang memenuhi standar optimal dapat dicapai melalui pelaksanaan prosedur dan pengujian DNA yang baku dengan mencermati proses yang terjadi mulai dari pemecahan dinding sel dengan penggerusan jaringan hingga diyakini efisiensi dan efektifitasnya. Selanjutnya pemecahan membran sel dilakukan dengan mengoptimalkan pemberian buffer ekstraksi/CTAB. Buffer ekstraksi/CTAB dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya karakteristik perbedaan kelarutan antara keduanya (Rogers dan Bendich, 1988).
Sebagian besar metode isolasi DNA tanaman termasuk kit komersial memerlukan penggilingan bahan tanaman dengan nitrogen cair yang bertujuan untuk membantu memecahkan dinding sel. Berdasarkan hal ini, setiap jaringan yang direndam dalam nitrogen cair langsung menjadi padat rapuh sehingga mudah menghancurkannya menjadi bubuk, dengan keuntungan tambahan dapat menjaga jaringan pada suhu rendah.
Pasir kuarsa atau bubuk kaca dapat digunakan untuk menggiling daun aren seperti yang telah dilakukan Ibrahim dkk. (2010) pada tanaman kurma. Tujuan pemberian pasir kuarsa sama halnya dengan pemberian N2
Teknik yang digunakan dalam penelitian ini salah satunya kombinasi penambahan antioksidan PVPP dan mercaptoetanol pada buffer ekstraksinya. Dengan kombinasi ini dihasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang baik. PVPP Cair yaitu membantu memecahkan dinding sel. Isolasi DNA menggunakan pasir kuarsa juga telah banyak dilakukan pada spesies tanaman hutan. Hal ini disebabkan dalam laboratorium kecil di banyak negara berkembang, nitrogen cair tidak selalu tersedia. Disamping itu penyimpanan dan pemeliharaan nitrogen cair juga sulit (Ibrahim dkk., 2010).
dan β-mercapthoethanol akan mereduksi senyawa-senyawa fenolik yang keberadaannya dapat merusak kualitas DNA.
Proses penggerusan atau homogenasi daun aren tidak menggunakan nitrogen cair, tetapi ditambahkan 0.5 ml buffer ekstraksi CTAB yang mempunyai fungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Syafaruddin dan Santoso (2011), menyatakan bahwa buffer ekstraksi CTAB digunakan untuk mengisolasi DNA pada tanaman kemiri susan yang menghasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang cukup baik.
Menghindari kemungkinan adanya kontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder dilakukan kombinasi penambahan antioksidan PVPP dan mercaptoethanol pada buffer ekstraksinya. Hasil penelitian menunjukkan kombinasi ini menghasilkan kualitas DNA yang cukup baik. Hal ini sesuai dengan penelitian Syafaruddin dan Santoso (2011) yang menyatakan bahwa PVPP dan mercaptoethanol akan mereduksi senyawa-senyawa fenolik yang keberadaannya dapat merusak kualitas dan kuantitas DNA.
DNA yang sudah dilepas kedalam larutan buffer harus dapat dilindungi dari aktifitas nuclease endogenous. Hal ini dapat diatasi dengan adanya EDTA dalam buffer ekstraksi yang dapat mengikat ion Mg, yaitu sebagai kofaktor yang diperlukan untuk aktifitas berbagai enzim nuclease (Rogers and Bendich, 1988).
Selain itu tingkat kemurnian DNA yang tinggi dapat diperoleh melalui pencucian berulang dengan penambahan kloroform atau KIAA agar protein mengalami denaturasi dan terpisah dari DNA. Kontaminan lain yang juga mengurangi kemurnian DNA menjelang berakhirnya isolasi adalah masih tercampurnya RNA bersama pelet DNA.
Untuk membuktikan bahwa DNA yang telah diperoleh mempunyai kualitas dan kuantitas yang baik maka DNA tersebut digunakan sebagai cetakan untuk analisis PCR-RAPD. Hasil amplifikasi PCR-RAPD menggunakan primer OPD-12 menunjukkan bahwa DNA yang diamplifikasi menghasilkan pita DNA yang sangat baik dimana pola pita terlihat jelas dan terang. Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa teknik isolasi DNA yang dipakai sangat memberikan hasil yang sangat nyata dan memenuhi syarat untuk digunakan dalam ektraksi DNA aren. Beberapa penelitian tentang optimasi isolasi DNA dan protokol untuk PCR- RAPD telah dilakukan pada tanaman tahunan kemiri susan (Syafaruddin dan Santoso, 2011), kurma (Ibrahim dkk, 2010).
Hasil pengujian kualitas DNA pada ketiga metode di atas cukup baik, hasil ini dapat menentukan keberhasilan amplifikasi PCR. Menurut Waugh (1997), beberapa faktor yang mempengaruhi kehandalan reaksi RAPD diantaranya adalah kondisi dan konsentrasi DNA, ko-esktraksi pengkontaminan dan interferensi amplifikasi. Kriteria yang akan diampliikasi untuk stok DNA, paling tidak mengandung seutas DNA utuh dan ada regium dan bebas dari kontaminan.
Kesimpulan
Tiga metode modifikasi untuk optimasi memberikan hasil yang cukup baik dengan pola pita PCR yang dapat dikenali. Maka dipilih metode pertama untuk digunakan dalam penelitian II yaitu tanpa menggunakan N2 cair dan pasir kuarsa karena lebih sederhana, murah dan cepat dibandingkan dengan menggunakan nitrogen cair yang cukup mahal dan sulit dalam penyimpanan dan pemeliharaannya. Sedangkan jika menggunakan pasir kuarsa sulit diperoleh dan
kemungkinan masih ada elemen-elemen lain yang terkandung dalam pasir kuarsa tersebut meskipun telah disterilisasi.
PENELITIAN II : PEMAKAIAN MARKA RAPD UNTUK ANALISIS