PENELITIAN I : OPTIMASI DAN MODIFIKAS
3. Menggunakan N2 Cair
Isolasi dan Pemurnian DNA
Daun aren yang berasal dari 10 pohon yang berbeda dari Batangtoru (Tapanuli Selatan) ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus. Potongan daun yang ada dalam mortar ditambah N2 cair. Daun digerus sampai halus searah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g PVPP, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10 µl β- mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan nomor pohon yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65o
Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA kedalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4o
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4
C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan 100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan buffer TE (Orozco-Castillo dkk., 1994).
o
C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stock DNA yang diperoleh disimpan pada suhu ± 200 C bila tidak digunakan (Orozco-Castille dkk., 1994).
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan cara memasukkan 2µl DNA stok ditambah 8 ml aquades steril ditambah 2µl loading buffer ke dalam tabung mikro 2 ml dan dihomogenkan.
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v). Agarose ditimbang 0,28 g kemudian dilarutkan kedalam 35 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume dalam tabung berkurang maka ditambah aquades sampai batas tanda dan kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan ditambah
larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara dialirkan tabung tersebut pada air yang mengalir.
Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o
Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.
C), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis dan diberi larutan TAE 1x ± 670 ml (hingga terendam). Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Pada saat stok DNA akan dimasukkan ke dalam sumur gel, maka setiap stok DNA diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2µl dan stok DNA 8µl kemudian dicampur dengan mikropipet dan setelah rata masing-masing dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dan didokumentasikan.
Amflifikasi/ genotyping
Amplifikasi mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur William dkk., (1990). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer OPD- 12 polimorpik dari Sigma-Aldrich yang telah terbukti menunjukkan polimorfisme pada kelapa sawit di Indonesia (Retno dkk, 2001) dengan pertimbangan aren dan kelapa sawit satu famili yaitu palmae (palem-paleman).
Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5 µl stok DNA dan ditambah 45µl ddH2O sehingga diperoleh 50 µl aliquot DNA. Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu dengan mengambil 10-15 µl stok primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Kemudian dibuat larutan master dengan contoh : dd H2O 9.5 µl x 5 = 47,5 µl, Go Tag 12,5 µl x 5 = 62,5 µl, aliquot primer 1 µ x 5 = 5 µl. Dari tube diambil 23 µl ke tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan 2 µl masing masing DNA. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan annealing 36 O
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu ± 20
C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied Biosystems di desain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada Tabel 1.
o
Tabel 1. Proses Amplifikasi PCR C bila sedang tidak digunakan.
No Tahapan Suhu Waktu Jumlah siklus
1 2 3 4 5 6 Denaturasi awal Denaturasi Annealing Ekstension Ekstension akhir Kondisi akhir PCR 94o 94 C o 36 C o 72 C o 72 C o 4 C o 2 menit C 1 menit 1 menit 2 menit 10 menit Tak terbatas 1 45 45 45 1 1
‘ Telah dikembangkan untuk kelapa sawit (Setiyo, 2001)’.
Elektroforesis
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 % (b/v). Agarose ditimbang 0,525 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 35
ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening. Kemudian didinginkan dengan dialirkan tabung tersebut pada air mengalir, kemudian Ethidium Bromida ditambahkan 1 µl dan dipanaskan kembali. Setelah larutan dipanaskan kemudian didinginkan dengan cara yang sama. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tank elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml (hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang telah ditentukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel.
C) larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras. Well-forming combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.
Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 70 menit. Setelah running elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tary diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.