Metedologi Penelitian

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat – Alat

1. Gelas ukur 50 ml/100 ml Pyrex 2. Gelas Beaker 250 ml/1000ml Pyrex

3. Gelas Erlenmeyer 250 ml Pyrex

4. Corong kaca

5. Corong pisah 500 ml Pyrex

6. Kolom kromatografi Pyrex

7. Tabung reaksi Pyrex

8. Bejana maserasi 10 L Schott/Duran

9. Rotari evaporator Buchi R-114

10. Kertas aluminium 7,6 m x 300 mm Total Wrap 11. Statif dan klem

12. Lampu UV 254 nm/356 nm UVGL 58

13. Spatula

14. Neraca analitis Mettler AE 200

15. Pipet tetes

16. Penangas air Buchi B-480

17. Botol vial

18. Vakum Buchi B-169

19. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 20. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu

21. Spektrofotometer ‘H-NMR Jeol/Delta2NMR-500MHz 22. Spektrofotometer UV-Visible

3.2 Bahan – Bahan

1. Albedo jeruk bali merah ( Citrus maxima.Merr )

2. Metanol Teknis

3. n-Heksana Teknis

4. Etil asetat Teknis

5. Aquadest

6. Aseton Merck

7. Kloroform

8. Silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM E.Merck. KGaA 9. FeCl3 5%

10. NaOH 10% 11. Mg-HCl 12. H2SO4(p)

13. Pelat KLT silika gel 60 F₂₅₄

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1. Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah albedo jeruk bali merah yang diperoleh dari daerah Rambung Baru, Sembahe, Kecamatan Sibolangit, Kabupaten Deliserdang , Sumatera Utara. Albedo jeruk bali merah dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk albedo jeruk bali merah sebanyak 1030 gram.

3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Albedo Jeruk Bali Merah

Serbuk albedo jeruk bali merah diidentifikasi dengan menggunakan cara : 1. Skrining fitokimia

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada albedo jeruk bali merah, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :

- Dimasukkan ± 10 gram serbuk albedo jeruk bali merah (C Maxima Merr.) yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam Erlenmeyer

- Ditambahkan metanol ± 100 ml

- Didiamkan

- Disaring

- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi

- Ditambahkan masing-masing pereaksi

a. Tabung I : dengan FeCl3 5 % menghasilkan larutan berwarna hitam. b. Tabung II : dengan H2SO49p) menghasilkan larutan berwarna orange

kekuningan.

c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan bewarna merah muda. d. Tabung IV : dengan NaOH 10 % menghasilkan larutan bewarna biru violet.

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F₂₅₄ Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 v/v).

Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat (90:10 v/v) ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan perekasi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan ( 80:20; 70:30; 60:40 v/v). Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam albedo jeruk bali merah terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan

yang baik diberikan pada fase gerak n-heksana : etil asetat ( 80:20 v/v) LAMPIRAN C.

3.3.3. Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Albedo Jeruk Bali Merah

Serbuk albedo jeruk bali merah ditimbang sebanyak 1030 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 9 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 72 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap.

3.3.4. Pemisahan Tanin

Ekstrak pekat metanol dari serbuk albedo jeruk bali merah di diuapkan sampai pelarut metanol menguap habis, kemudian dilarutkan dengan pelarut etil asetat untuk memisahkan tanin dengan flavonoida, yang mana tanin tidak larut dalam pelarut etil asetat. Kemudian disaring dan filtrat yang didapatkan dirotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol bebas tanin.

3.3.5. Hidrolisa

Ekstrak pekat metanol bebas tanin dihidrolisa yang bertujuan untuk memutuskan ikatan gula pada senyawa flavonoida dengan menggunakan HCl 6%. Ekstrak pekat metanol bebas tanin dilarutkan dengan HCL 6% dengan perbandingan sampel dan HCl 2:5, dipanaskan diatas penangas air selama ± 30-40 menit, kemudian disaring dan didapatkan filtrat yang sudah bebas gula.

3.3.6. Ekstraksi Partisi dengan Kloroform

Filtrat yang sudah bebas gula diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang, sehingga didapatkan ekstrak kloroform dan dipekatkan kembali dan dipanaskan sampai kering sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,575 gr.

3.3.7. Pemisahan Komponen dengan Kromatografi Kolom

Pemisahan komponen secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100%, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10 v/v, 80:20 v/v, 70:30 v/v dan 60:40 v/v). Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dengan menggunakan n-heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 1,575 g ekstrak metanol albedo jeruk bali merah kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksan: etil asetat ( 90:10) v/v secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80:20v/v,70:30v/v dan 60:40 v/v). Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 8 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl₃ 5%. Kemudian diuapkan sampai terbentuk Kristal. Kristal yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan Me-OH lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk preparatif KLT.

Kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang berukuran 20x20 yang telah dibuat garis batas bawah dan batas atas sepanjang 2 cm, plat yang digunakan harus sudah diaktifkan terlebih dahulu. Plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan,

kemudian ditutup. Setelah dielusi plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan dikeruk lalu dielusi dengan perbandingan pelarut metanol dan etil asetat 1:1. Hasil elusi diuapkan sehingga diperoleh kristal.

3.3.8Pemurnian Hasil Isolasi

3.3.8.1 Pemurnian Hasil Isolasi Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Senyawa hasil isolasi di murnikan kembali dengan cara kromatografi lapis tipis preparatif ketika masih terdapat dua noda atau lebih, kristal hasil isolasi dari kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etil asetat kemudian ditotolkan pada plat KLT yang berukuran 20x20 yang telah diberi batas atas dan batas bawah, kemudian noda dikeringkan dan ditotolkan lagi berulang dengan cara penotolan horizontal lalu dikeringkan kembali sapai benar-benar terserap silika pada plat KLT yang digunakan. Dimasukkan plat KLT pada chamber yang berisi perbandinagn pelarut yang sesuai untuk menaikkan noda yaitu digunakan benzena : aseton (8:2) v/v pada saat mencapai batas atas plat KLT diangkat dan didiamkan kemudian dimasukkan kembali sampai 3 kali pemasukan plat kedalam chamber supaya noda-nodanya benar-benar terpisah dengan baik, kemudian diangkat dan dikeringkan, plat disinari dengan lampu UV kemudian ditandai noda yang terpisah kemudian dikeruk dengan menggunakan alat pengeruk dan dimasukkan kedalam kolom kecil yang dibawahnya telah dibuat kapas sebagai penyaringnya kemudian diekstraksi pada kolom kecil tersebut dengan menggunakan pelarut metanol:etil asetat (1:1) dibiarkan sampai filtratnya habis turun, filtrat yang ditampung dikristalisasi dengan penguapan kembali pelarut sampai terbentuk kristal, kemudian di KLT kembali untuk melihat apakah kristal sudah murni dengan 1 noda dan positif dengan test FeCl3 dan terlihat pada lampu UV.

3.3.8.2 Rekristalisasi

Senyawa yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat diaduk sehingga semua padatan larut sempurna. Kemudian ditambahkan n-heksan, yang mana tidak dapat melarutkan senyawa yang diisolasi, secara perlahan-lahan sehingga terjadi pengendapan senyawa didasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari yang masih tertinggal sehingga diperoleh padatan yang benar-benar bebas dari pelarut.

3.3.9 Uji Kemurnian Hasil Isolasi

3.3.9.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Uji kemurnian kristal yang dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F₂₅₄ dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat (80:20 v/v). Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak kedalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl₃ 5% dalam metanol menghasilkan bercak bewarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.

3.3.9.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi Dengan Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.

3.3.10. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.10.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Pennelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.

3.3.10.2. Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)

Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR ddiperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang.

3.3.10.3. Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (¹H-NMR)

Analisis dengan alat Spektrometer ¹H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut.

3.4. Bagan Skrining Fitokimia

3.4.1 Bagan Skrining Fitokimia dengan Metanol

10 g serbuk albedo jeruk bali merah ( Citrus maximaMerr.)

Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring

Tabung I Tabung II Tabung III _{Tabung IV}

Ditambahkan pereaksi FeCl₃ 5% Diamati perubahan warna Ditambahkan pereaksiNaOH 10% Diamati perubahan warna Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Ditambahkan pereaksi H₂SO_4(p) Diamati perubahan warna

Larutan Hitam ^{Larutan biru} kehijauan Larutan merah jambu Larutan orange kekuningan Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida

3.4.2 Bagan Skrining Fitokimia dengan Etil Asetat

Serbuk albedo jeruk bali merah

( Citrus maximaMerr. )

diekstraksi maserasi dengan etil asetat

disaring

dibagi ke dalam 4 tabung reaksi

Tabung I Tabung II Tabung III _{Tabung IV}

ditambahkan

pereaksi

FeCl

₃

1%

diamati

perubahan

warna

Larutan hitam

ditambahkan

pereaksi

NaOH 10%

diamati

perubahan

warna

Larutan

biru violet

ditambahkan

pereaksi

Mg-HCl

diamati

perubahan

warna

Larutan

merah muda

ditambahksn

pereaksi

H

₂

SO

_4(p)

diamati

perubahan

warna

Larutan

orange kekuningan

Positif

flavonoid ^Positif_flavonoid

Positif

flavonoid

Positif

flavonoid

Serbuk albedo jeruk bali merah ( Citrus maxima Merr.)

Diskrining fitokimia Dimaserasi dengan metanol Didiamkan selama 1 hari Diulangi sebanyak 2 kali Disaring

Ekstrak metanol

Diskrining fitokimia

Dipekatkan dengan rotari evaporator Diuapkan pelarut metanol sampai habis dengan waterbath

Residu

Ekstrak pekat metanol

Dilarutkan dengan etil asetat berulang-ulang sampai bening

Disaring

Ekstrak etil asetat

( bebas tanin ) ^Residu

Dirotari evaporator

Diuapkan pelarut etil asetat sampai habis diatas waterbath

Ekstrak pekat etil asetat

Dikeringkan ( sampai bau etil asetat hilang ) Dilarutkan dengan metanol

Lapisan metanol

Dipekatkan dengan rotari evaporator

Dihidrolisa dengan menggunakan 2N HCl ( 6% ) dengan perbandingan sampel dan HCl ( 2:5 )

Dipanaskan diatas waterbath selama 60 menit sambil diaduk

Disaring ( Mabry dkk,1970)

Larutan metanol asam _Residu

Diekstraksi partisi dengan klorofom Ditest dengan FeCl₃ sampai negatif Lapisan klorofom

Dirotarievaporator

Diuapkan hingga klorofom habis Ekstrak pekat klorofom

Diskrining fitokimia

Diuji KLT untuk menegtahui sistem eluen yang sesuai pada kromstogrsfi kolom

Dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel 60 GF (0,063-0,200 mm) dan fasa gerak n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 v/v

Ditampung setiap fraksi 10 ml dalam botol vial Diuji KLT untuk mengetahui harga Rf

Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama

Fraksi 1-34(227 mg) farksi n-heksan total, berbentuk minyak

Fraksi 35-45 (150 mg) fraksi eluen n-heksana: etil asetat (90:10) v/v berbentuk lemak

Fraksi 46-68 (132,9 mg) fraksi eluen n-heksana: etil asetat (80:20) v/v berbentuk padat

Fraksi 69-105 (80,5 mg) fraksi eluen n-heksana: etil asetat (70:30) v/v berbentuk padat

Fraksi 106-150(100,2 mg) dari eluen n-heksana: etil asetat (60:40) v/v berbentuk padat

DiKLT dengan eluen n-heksana:etil asetat (80:20) v/v Ditest dengan FeCl₃

terdapat 3 noda, (+) pada FeCl₃ dan terdapat adsorpsi UV DiKLT

Ditest dengan FeCl₃ Dilihat dibaweah sinar UV

tidak terdapat noda, (-) pada FeCl₃dan (-) adsorpsi UV

DiKLT dengan eluen n-heksana:etil asetat (90:10) v/v Ditest dengan FeCl₃

tidak terdapat noda, (-) pada FeCl₃dan (-) adsorpsi UV

DiKLT dengan eluen n-heksana:etil asetat (70:30) v/v Ditest dengan FeCl₃

DiKLT dengan eluen n-heksana:etil asetat (60:40) v/v Ditest dengan FeCl₃

terdapat 4 noda, (+) pada FeCl₃ dan terdapat adsorpsi UV

tidak terdapat noda, (-) pada FeCl₃ dan (-) pada adsorpsi UV DiKLT Perparatif dengan

fase diam silika gel dan fase gerak benzena: aseton (8:2) v/v

Direkristalisasi Dianalisiss KLT Diukur masaanya

Diuji titik leburnya

Dianalisa dengan Spektrofotometer UV-Visible,FT-IR dan Spektrofotometer ¹H-NMR Hasil analisa Dilihat dibaweah sinar UV Dilihat dibaweah sinar UV Dilihat dibaweah sinar UV Dilihat dibaweah sinar UV