BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
B. Metoda Penelitian
1. Tahap 1 Pembuatan kultur
a. Pembuatan Kultur BAL L. plantarum 2C12 dan L. fermentum 2B4.
Kultur induk L. plantarum 2C12 dan L. fermentum 2B4 dari penelitian Arief (2008) disegarkan terlebih dahulu pada media de Man Rogosa Sharpe Broth (MRSB). Kemudian dari kultur yang disegarkan tersebut dibuat kultur kerja. Setelah itu, kultur kerja dipupukkan pada media de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) untuk diketahui populasinya. Kultur yang memenuhi syarat untuk digunakan cekok pada tikus percobaan yaitu kultur dengan jumlah populasi 108 cfu/ml.
Kultur stok yang telah dibuat perlu diperbaharui setiap minggu agar aktivitasnya tidak berkurang. Pemeliharaan kultur stok pada penelitian ini akan menggunakan metode Hariyadi et al. (2001) dengan cara membuat tusukan kultur pada MRSA chalk semisolid, kemudian menginokulasikannya pada MRSB, lalu kultur tersebut dapat disimpan di refrigerator.
b. Pembuatan Kultur EPEC
Kultur EPEC dibiakkan pada media Nutrien Agar selama 24 jam pada suhu 37°C untuk dijadikan kultur kerja. Setelah itu diambil sebanyak satu ose kultur kerja tersebut lalu dibiakkan ke dalam tabung berisi media Nutrien Broth. Setelah 24 jam kultur bakteri uji disetarakan kekeruhannya dengan standar Mc. Farland no 0.5, yang memiliki kesetaraan dengan jumlah populasi bakteri sebesar 8x108 sel bakteri/ml. Suspensi bakteri EPEC yang terbentuk kemudian diencerkan sampai diperoleh konsentrasi 8x106 sel bakteri/ml.
2. Tahap 2 Pengujian In vivo
a. Pengelolaan Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih albino Norway rats (Rattus novergicus) galur Sprague
30
Dawley umur 5-6 minggu berjenis kelamin jantan hasil pengembangbiakan dari Badan POM RI.
b. Kandang dan Perlengkapan
Kandang yang digunakanadalah kandang yang berukuran 17,5 x 23,75 x 17,5 cm milik Laboratorium Hewan Percobaan Seafast, dengan jumlah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan. Kandang terbuat dari stainless steel. Kandang tikus harus berlokasi pada tempat yang bebas dari suara ribut, dan terjaga dari asap industri atau polutan lainnya. Lantai harus mudah dibersihkan dan disanitasi. Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24 ºC dan kelembaban udara 50 – 60 %, dengan ventilasi yang cukup (namun tidak ada jendela terbuka) (Muchtadi 1993).
c. Persiapan dan Pembuatan Ransum
Ransum yang diberikan kepada tikus percobaan mengacu pada AOAC (Association of Official Agricultural Chemists) (Muchtadi et al., 1992). Komposisi ransum standar disusun berdasarkan standar AOAC seperti pada Tabel 7. Semua kelompok tikus diberikan ransum standar.
Tabel 7. Komposisi Ransum Standar
Bahan-bahan campuran Jumlah (%)
Protein kasein Minyak jagung Campuran mineral Campuran vitamin CMC Air
Maizena (pati jagung)
10 8 5 1 1 5 Untuk membuat 100% Sumber : Muchtadi et al. (1992).
d. Perlakuan anti-E.coli Enteropatogenik (EPEC) secara in vivo
Pengujian ini dilakukan sesuai petunjuk Zoumpopoulou et al.
(2008) hanya berbeda bakteri patogen yang digunakan. Dua buah kultur bakteri asam laktat terpilih berumur satu hari pada media MRS broth sebanyak 1 ml dengan populasi 108 cfu diberikan sesuai dengan
31 perlakuan kepada tikus percobaan, sedangkan populasi Enteropatogenik E. coli penyebab diare yang diberikan adalah sebesar 106 cfu/ml sebanyak 1 ml yang didasarkan bahwa dosis infeksi Enteropatogenik E.coli adalah minimal 105 cfu/ml (Oyetayo, 2004). Tikus dibagi menjadi 6 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 15 ekor tikus sebagai ulangan dengan kelompok seperti disajikan pada Tabel 8 dan Gambar 5.
Sebelumnya, dilakukan adaptasi tikus terhadap lingkungan selama tiga hari dengan pemberian makan ransum standar terhadap semua tikus. Selain itu juga terdapat kelompok baseline, yang terdiri dari 5 ekor tikus, tikus kelompok ini juga dipelihara selama masa adaptasi tiga hari dan setelah itu dibedah untuk dilakukan analisa semua peubah sebagai data awal sebelum perlakuan.
Tabel 8. Kelompok tikus perlakuan
Kelompok tikus Perlakuan
Kontrol negatif Tikus normal diberikan ransum standar dan diberikan akuades secara oral menggunakan sonde
BAL L. plantarum
2C12
Tikus yang hanya diberikan ransum standar, diiringi pemberian BAL L. plantarum 2C12 BAL L. fermentum
2B4
Tikus yang hanya diberikan ransum standar, diiringi pemberian BAL L. fermentum 2B4 BAL L. plantarum
2C12 + EPEC
Tikus yang diberikan ransum standar, diiringi pemberian BAL L. plantarum 2C12, tetapi diselingi dengan pemberian infeksi EPEC. BAL L. fermentum
2B4 + EPEC
Tikus yang diberikan ransum standar, diiringi pemberian BAL L. fermentum 2B4, tetapi diselingi dengan pemberian infeksi EPEC. Kontrol positif Tikus yang diberikan ransum standar dan
infeksi EPEC
Setiap perlakuan terdiri dari 15 ekor tikus sebagai ulangan. Pembedahan tikus untuk dilakukan analisis peubah yang diamati
32 dilakukan pada hari ke-7, 14 dan 21 masing-masing 4 ekor. Selain itu, terdapat pula 5 ekor tikus sebagai kelompok baseline yang akan dibedah pada hari ke-0 setelah masa adaptasi. Dengan demikian diperlukan 95 ekor tikus.
Masa perlakuan dilakukan selama 21 hari. Selama masa perlakuan, semua kelompok tikus diberikan ransum stándar dan pemberian air minum diberikan secara ad libitum. Pengamatan yang dilakukan yaitu jumlah konsumsi ransum dan berat badan tikus percobaan. Banyaknya ransum yang dikonsumsi dihitung setiap hari dengan menimbang sisa ransum yang tidak dikonsumsi oleh tikus. Pengamatan berat badan masing-masing tikus dilakukan setiap tiga hari sekali selama perlakuan. Hasil yang diperoleh kemudian dibandingkan antar kelompok.
e.Analisis Hematologi
Analisis kondisi hematologi dilakukan sesuai Aboderin dan Oyetayo (2006). Analisis kondisi hematologik dilakukan dengan alat diagnosa kesehatan tubuh dan parameter status imun darah yaitu leukosit (sel darah putih). Prosedur analisisnya sebagai berikut: Sampel darah tikus diambil dari tikus melalui ‘cardiac puncture’ ke dalam cube yang berisi EDTA. Analisis dilakukan dengan
Cekok BAL Adaptasi H(-3) H(0) H(7) H(14) H(21) Cekok EPEC T0 T1 T2 T3 Keterangan :
T0 = terminasi awal (4 tikus)
T1 = terminasi 1 (4 tikus setiap kelompok) T2 = terminasi 2 (4 tikus setiap kelompok) T3 = terminasi 3 (4 tikus setiap kelompok)
33 menggunakan alat otomatik ‘Hematology Analyzer’ dengan parameter eritrosit, hematokrit, hemoglobin, trombosit, dan leukosit.
f. Rancangan percobaan
Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap, dengan model matematika sbb :
Yij = + αi +βj + ε ij
Yij : pengaruh perlakuan pada tikus (kelompok tikus) ke -i dan ulangan ke-j.
: nilai tengah perlakuan. αi : pengaruh perlakuan ke.-i. βj : pengaruh ulangan ke-j.
ε ij : galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j.
Data dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Jika terdapat perbedaan nyata akan diuji lanjut dengan uji Duncan (Steel dan Torrie, 1995).
34
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN