DAFTAR LAMPIRAN
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April 2011 hingga November 2011. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST IPB dan Laboratorium Pengolahan ITP Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah 8 isolat Cronobacter spp. yaitu DES b10 (JF800179), DES c13 (JF800181), DES b7a, DES d3, YR t2a (JF800182), YR c3a (JF800182), 6a (AY624069), dan ATCC 51329 (AY752937) yang berasal dari susu formula, tepung maizena, bubuk coklat, dan makanan bayi (Tabel 3). Media pertumbuhan berupa Tryptic Soy Agar Yeast Extract (TSAYE) (TSA, Oxoid CM0131). Media kultur menggunakan Brain Heart Infusion Broth
(BHIB, Oxoid CM0225). Menstruum susu formula bayi digunakan untuk mengkaji ketahanan panas isolat Cronobacter spp. Buffered Peptone Water
(BPW, Oxoid CM0509) digunakan untuk pengenceran. HCl dan NaOH digunakan untuk mengatur pH bufer Mcllvaine. Bufer Mcllvaine ditambahkan dengan NaCl atau sukrosa digunakan untuk mengatur aw.
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah tabung TDT yang terbuat dari gelas Pyrex dengan panjang 150 mm, diameter dalam (ID) 7 mm, dan diameter luar (OD) 9 mm. Water bath (Seri A07101004), laminar air flow,
autoclave,thermocouple, stop watch, termometer, neraca analitik, inkubator, pipet volumetrik, pipet mikro, gelas pengaduk, jarum ose, labu Erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, cawan petri, pengaduk magnet, dan vorteks.
Tabel 3 Daftar isolat Cronobacter spp. yang digunakan
Nama isolat Asal isolat Nomor Akses sekuen gen 16S rRNA di Gen Bank
DES b7a Makanan Bayia -
DES b10 Makanan Bayia JF800179
DES c13 Maizenaa JF800181
DES d3 Bubuk Coklata -
YR t2a Susu Formula Bayib JF800182
YR c3a Susu Formula Bayib JF800182
6a Formula Lanjutan Bayic AY624069
ATCC 51329 Klinisd AY752937
a Dewanti-Haryadi (2011) b Meutia (2008) c Estuningsih et al. (2006) d Iversen et al. (2004) Metodologi Penelitian
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan yaitu penelitian pendahuluan untuk menentukan lag time (waktu tunda), penentuan kinetika inaktivasi
Cronobacter spp., dan pengujian ketahanan panas satu isolat Cronobacter spp. dalam sistem bufer. Tahapan penelitian ini dapat dilihat pada diagram alir penelitian (Gambar 4). Waktu tunda merupakan waktu yang dibutuhkan untuk untuk mencapai suhu yang diinginkan (kondisi isotermal). Pengaruh kinetika inaktivasi terhadap isolat Cronobacter spp. dievaluasi dengan membuat kurva kinetika inaktivasi pada berbagai suhu konstan yaitu 50, 52, 54, 56, dan 58 C. Sensitivitas beberapa nilai D terhadap suhu akan dievaluasi dengan penentuan nilai Z. Selain itu pengujian ketahanan panas satu isolat Cronobacter spp. dalam sistem bufer dilakukan pada berbagai aw dan pH.
Keterangan: *) Penentuan parameter kinetika inaktivasi dilakukan setelah pemanasan mencapai suhu konstan yang diinginkan, yaitu setelah melewati waktu tunda.
Gambar 4 Diagram alir penelitian
Penentuan Parameter Kinetika Inaktivasi Isolat Cronobacter spp.
Kajian kinetika inaktivasi dilakukan pada lima suhu yang berbeda yaitu 50, 52, 54, 56, dan 58 C. Kajian kinetika inaktivasi terdiri atas penentuan waktu tunda, persiapan inokulum, persiapan menstruum pemanas, dan uji kinetika inaktivasi isolat Cronobacter spp. Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut.
Penentuan Waktu Tunda. Waktu dan suhu pengukuran diatur pada alat
thermocouple, waktu pengukuran diatur pada rentang 1 menit sedangkan suhu Penentuan waktu tunda
Penentuan parameter kinetika inaktivasi*) 7 isolat lokal Cronobacter spp dan 1 isolat Cronobacter
muytensii (ATCC 51329) terhadap panas
Ketahanan panas satu isolat lokal dalam sistem bufer (pengaruh aw dan pH pada media perlakuan)
Nilai D pada berbagai aw Nilai D pada berbagai pH
Nilai D Nilai z
pengukuran diatur dalam celsius ( C). Kabel thermocouple diletakkan di tengah tabung TDT yang diisi media susu formula, di samping tabung TDT, dan di rak tabung kemudian alat thermocouple dinyalakan. Tabung TDT yang berisi
menstruum susu formula dan kabel thermocouple lalu dimasukkan dalam water bath pada suhu 50, 52, 54, 56, dan 58 C. Setiap rentang 1 menit maka
thermocouple akan mencetak suhu dari water bath yang mencapai kabel
thermocouple.
Pesiapan Inokulum. Semua isolat yang berada dalam agar miring TSA dipindahkan kedalam BHIB dan ditumbuhkan selama 17 jam pada suhu 37 C sehingga jumlahnya mencapai 108-109 CFU/ml (Permadi 2010).
Persiapan Menstruum Pemanas. Menstruum pemanas yang digunakan dalam kajian kinetika inaktivasi isolat Cronobacter spp. adalah susu formula bayi. Pembuatan susu formula sebagai menstruum pemanas dilakukan dengan mengikuti instruksi penyajian susu seperti yang tertera dalam kemasan, 13.2 gram susu direkonstitusi dengan 90 ml air bersuhu 70 C. Penggunaan air bersuhu 70 C digunakan untuk mencegah terjadinya kontaminasi susu oleh mikroba. Selanjutnya sebanyak 1.8 mL susu formula yang telah direkonstitusi dimasukkan kedalam Tabung TDT.
Kinetika Inaktivasi Isolat Cronobacter spp. (Lang & Smith 2008).
Kedalam tabung TDT steril yang telah berisi 1.8 mL menstruum ditambahkan dengan 0.2 mL inokulum yang mengandung kultur bakteri Cronobacter spp. sebanyak 108-109 CFU/mL kemudian divorteks setelah itu diletakkan dalam rak tabung. Rak tabung yang berisi tabung TDT kemudian dimasukkan dalam water bath dengan suhu yang konstan yaitu 50, 52, 54, 56, atau 58 C. Pemanasan dilakukan dengan mengkombinasikan suhu dan waktu pemanasan dengan interval waktu yang sudah ditentukan. Setelah kombinasi waktu dan suhu tercapai, tabung TDT dari water bath dengan cepat dipindahkan kedalam wadah berisi es dan air untuk menghentikan proses inaktivasi oleh panas dengan pendinginan cepat.
Pendinginan cepat untuk mencapai 0 C terhadap sampel, dilakukan dalam waktu 5-6 menit sedangkan untuk memulihkan kembali (resusitasi) dari suhu 0 C ke suhu ruang sekitar 27 C terjadi selama 30-40 menit. Jumlah mikroorganisme yang hidup dihitung secara duplikat dengan metode sebar, dengan menyebarkan
0.1 mL sampel pada cawan berisi TSAYE kemudian diinkubasi pada 37 C selama 24 atau 48 jam (Lang & Smith 2008). Prosedur inaktivasi diulang triplo
untuk setiap kondisi suhu percobaan: 50, 52, 54, 56 dan 58 C.
Perhitungan Koloni (BAM 2001). Perhitungan jumlah koloni dilakukan untuk melihat isolat yang dapat bertahan setelah perlakuan panas. Jumlah koloni yang dihitung berkisar antara 25-250 koloni. Isolat Cronobacter spp. yang terpilih digunakan untuk penentuan kinetika inaktivasi isolat Cronobacter spp.. Jumlah koloni bakteri dapat dihitung dengan rumus standard plate count sebagai berikut:
N = Σ C/[ (1*n1) + (0.1*n2) ] * (d)
Keterangan: N = jumlah koloni per ml atau per gram produk C = jumlah semua koloni yang dihitung dari 2 cawan n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama
n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua d = pengenceran pertama yang dihitung
Perhitungan Nilai D dan Nilai Z. Penurunan jumlah bakteri dikonversi menjadi nilai log Nt/N0 dan diplotkan kedalam kurva semilog pada sumbu y sedangkan sumbu x menunjukkan lama pemanasan (menit) pada suhu konstan yang diujikan, yaitu pada suhu 50, 52, 54, 56 dan 58 C. Selanjutnya dilakukan perhitungan waktu reduksi desimal (nilai D) yaitu -1/kemiringan kurva. Nilai Z dihitung dengan membuat kurva hubungan nilai D tehadap suhu. Kurva tersebut dibuat dengan memplotkan suhu pengujian pada skala aritmatik dan nilai log D pada skala logaritmik. Nilai Z dapat dihitung dari garis lurus yang dihasilkan (Gambar 3).
Pengaruh aw dan pH pada Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp. dalam
Sistem Bufer
Pengaruh aw pada Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp. Tabung TDT diisi dengan menstruum bufer Mcllvaine (asam sitrat-disodium hidrogen fosfat) pH 7 (Lampiran 1) yang diatur aw nya dengan penambahan sukrosa atau NaCl. Tabung TDT lalu diinokulasikan dengan kultur Cronobacter spp. sebesar 108-109 CFU/ml yang kemudian dipanaskan dalam water bath dan dipertahankan (holding) pada suhu 56 C selama waktu tertentu (menit). Setelah itu tabung didinginkan dan dilanjutkan dengan resusitasi pada suhu ruang. Selanjutnya
bakteri disebar pada media TSAYE lalu diinkubasi selama 24 atau 48 jam pada suhu 37 C kemudian dihitung jumlahnya. Penurunan jumlah bakteri dikonversi menjadi nilai log Nt/N0 dan diplotkan sebagai sumbu y dan sumbu x menunjukkan lama pemanasan (menit). Nilai D56 C dapat ditentukan dari kemiringan kurva (Gambar 2).
Pengaruh pH pada Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp. Tabung TDT diisi menstruum bufer Mcllvaine yang diatur pHnya menjadi 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, dan 8.0 (Lampiran 2) dengan penambahan 1 N HCl atau 1N NaOH. Kedalam tabung diinokulasikan dengan kultur Cronobacter spp. sebesar 108-109 CFU/ml untuk kemudian dipanaskan dalam water bath dan dipertahankan (holding) pada suhu 56 C selama waktu tertentu (menit). Setelah itu tabung didinginkan lalu diresusitasi pada suhu ruang. Bakteri kemudian disebar pada media TSAYE dan diinkubasi selama 24 atau 48 jam pada suhu 37 C setelah itu dihitung jumlahnya. Penurunan jumlah bakteri dikonversi menjadi nilai log Nt/N0 dan diplotkan sebagai sumbu y dan sumbu x menunjukkan lama pemanasan (menit).