KINETIKA INAKTIVASI
Cronobacter
spp.
(Enterobacter sakazakii
)
DALAM SUSU FORMULA DAN SISTEM BUFER DENGAN
BERBAGAI a
wDAN pH PADA PROSES PEMANASAN
HERMAWAN SEFTIONO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASINYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kinetika Inaktivasi Cronobacter spp.
(Enterobacter sakazakii) dalam Susu Formula dan Sistem Bufer dengan Berbagai aw
dan pH pada Proses Pemanasan adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2012
Hermawan Seftiono
ABSTRACT
HERMAWAN SEFTIONO. Thermal Inactivation Kinetics of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) in Infant Formula and Buffer System with Various aw and
pH. Under direction of PURWIYATNO HARIYADI and RATIH DEWANTI-HARIYADI
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) is an emerging opportunistic pathogen thas has been reported to cause meningitis, septicemia, dan necrotizing enterocolitis (NEC) outbreaks linked to Powdered Infant Formula (PIF) consumption. Most of the outbreaks occurred in the hospital involving infants younger than 28 days old, premature infants, or infants with low birth weight (< 2500 g) possibly due to their undeveloped immune system. Cronobacter spp. may contaminate PIF during processing and or during its preparation prior to consumption. Several Cronobacter spp. isolates have been reported to have a higher heat resistance than other Enterobacter. Isolation of Cronobacter spp. from PIF, weaning foods, and other dry food has been reported in Indonesia. However, assessment on the heat resistance of the isolates is still limited. This research aimed to obtain the inactivation kinetics parameters (D, Z values) of local isolates of
Cronobacter spp. in PIF and menstruum modified to achieve various aw and pH. The
study was conducted by inoculating late log phase culture of Cronobacter spp. into thermal death time (TDT) tubes containing PIF or PIF with various aw (modified
with sucrosa or NaCl) or adjusted with buffer Mcllvaine to achieve several pHs. TDT tubes were heated at constant temperatures of 50, 52, 54, 56, or 58 oC for 0-182 minutes. The number of Cronobacter spp. surviving the heating proces was enumerated on TSAYE. The correlation between heating time at different temperatures with the number of surviving Cronobacter spp. were plotted into TDT curves and the D and Z values were calculated. D-values of isolates of Cronobacter
spp. obtained in this study were in the range of 3.61-11.36 minutes at 56 oC and 68.97-256.41 minutes at 50 oC. These values were similar with the values reported by other researcher. Z-values calculated for isolates of Cronobacter spp. studied were 3.54-5.69 oC. The Z-values obtained were also within the range of those reported in the literatures. This study showed no significant effect of water activity (aw) and pH on inactivation kinetics of YR t2a isolate.
RINGKASAN
HERMAWAN SEFTIONO. Kinetika Inaktivasi Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) dalam Susu Formula dan Sistem Bufer dengan Berbagai aw dan pH pada
Proses Pemanasan. Dibimbing oleh PURWIYATNO HARIYADI dan RATIH DEWANTI-HARIYADI
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang, peritrichous, bersifat motil, dan termasuk ke dalam keluarga Enterobacteriaceae. Bakteri ini merupakan patogen baru yang terlibat dalam beberapa kasus seperti meningitis, septicemia, dan necrotizing enterocolitis (NEC). Sebagian besar kasus terjadi pada bayi prematur dengan usia kurang dari 28 hari atau bayi lahir dengan bobot badan rendah(< 2500 g) yang diduga memiliki respon imun yang rendah. Cronobacter spp. dapat mencemari susu formula selama proses pengolahan maupun penanganan sehingga inaktivasi bakteri patogen ini sangat penting untuk keamanan suatu produk. Beberapa isolat Cronobacter spp. dilaporkan memiliki ketahanan yang relatif lebih tinggi daripada Enterobacter lainnya.
Isolasi Cronobacter spp. dari susu formula dan produk pangan lainnya telah dilaporkan di Indonesia. Sampai saat ini kajian ketahanan panas isolat lokal
Cronobacter spp. masih sangat terbatas. Penelitian ini bertujuan mempelajari kinetika inaktivasi Cronobacter spp. lokal yang dinyatakan sebagai nilai D dan Z pada susu formula serta menentukan pengaruh aktivitas air (aw) dan pH terhadap laju
inaktivasinya.
Penelitian ini dilakukan dengan menginokulasikan kultur Cronobacter spp. fase log akhir ke dalam tabung Thermal Death Time (TDT) berisi susu formula atau
menstruum yang dikondisikan dengan sukrosa atau NaCl untuk mencapai aw tertentu
atau dengan bufer Mcllvaine untuk mencapai pH tertentu. Tabung kemudian dipanaskan pada suhu 50, 52, 54, 56, atau 58 oC selama 0-182 menit. Jumlah
Cronobacter spp. yang bertahan dihitung pada media TSAYE. Hubungan antara waktu pemanasan dan jumlah Cronobacter spp. yang bertahan diplotkan dalam suatu kurva TDT untuk menentukan nilai D dan Z.
Inaktivasi Cronobacter spp. dapat dijelaskan dengan kinetika reaksi orde satu sehingga dimana besarnya nilai D bervariasi untuk setiap isolat pada berbagai suhu. Penelitian ini menunjukkan bahwa nilai D untuk 8 isolat Cronobacter spp. yang dipelajari mempunyai kisaran antara 3.61-11.36 menit pada suhu 56 oC sampai 68.97-256.41 menit pada suhu 50 oC. Secara umum nilai D yang diperoleh tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan nilai D untuk bakteri sejenis yang dipelajari oleh peneliti lain. Sedangkan nilai Z untuk isolat Cronobacter spp. pada penelitian ini diperoleh dengan kisaran 3.54-5.69 oC. Nilai-nilai Z yang diperoleh pada penelitian ini juga mirip dengan nilai-nilai Z bakteri vegetatif dan khususnya
sukrosa dan NaCl tidak signifikan. Pengaruh pH menstruum terhadap kinetika inaktivasi isolat YR t2a juga tidak menunjukkan efek signifikan.
©Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar Institut Pertanian Bogor.
KINETIKA INAKTIVASI
Cronobacter
spp.
(Enterobacter sakazakii
)
DALAM SUSU FORMULA DAN SISTEM BUFER DENGAN
BERBAGAI a
wDAN pH PADA PROSES PEMANASAN
HERMAWAN SEFTIONO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Mayor Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tesis : Kinetika Inaktivasi Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) dalam Susu Formula dan Sistem Bufer dengan
Berbagai aw dan pH pada Proses Pemanasan
Nama : Hermawan Seftiono NIM : F251090201
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Purwiyatno Hariyadi, M.Sc. Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc.
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc. Dr. Ir. Dahrul Syah, Msc.Agr.
PRAKATA
Alhamdulillah puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis dengan judul Kinetika Inaktivasi Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) dalam Susu Formula dan Sistem Bufer dengan Berbagai aw dan pH pada
Proses Pemanasan. Shalawat dan salam semoga selalu tercurahkan pula kepada junjungan Nabi Besar, Muhammad SAW.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Purwiyatno Hariyadi, M.Sc dan Ibu Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc selaku komisi pembimbing yang telah meluangkan waktu, memberikan saran, bimbingan dan arahan kepada penulis dalam melakukan penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ibu, Bapak (alm) serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Juga kepada teman-teman seperjuangan, Ulfa, Riyanti, Wanny, Mbak Fenny, Mbak Tina, Mbak Ilul, Dede, Fitri, Bertha, Vanya, Eci, Rangga, Nandi, dan teman-teman IPN 2009 atas kebersamaan, dukungan serta bantuannya. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada seluruh staf di laboratorium Mikrobiologi SEAFAST yang senantiasa membantu selama penelitian ini berlangsung.
Tak lupa ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi atas pendanaan penelitian ini melalui skema Hibah Pascasarjana. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Februari 2012
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 19 September 1986 dari Ayah Yusuf Herman Widyalesmana (alm) dan Ibu Suwarni. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara.
Tahun 2004 penulis lulus dari Sekolah Menengah Atas Negeri 6 Bogor dan pada tahun yang sama diterima masuk di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan lulus pada bulan Desember tahun 2008. Setelah lulus Sarjana, penulis sempat bekerja sebagai asisten di Departemen Biokimia pada tahun 2008-2009.
DAFTAR ISI
Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii). ... 5Karakteristik Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii). ... 5
Sumber Kontaminasi Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) ... 7
Pengolahan dan Penyajian Susu Formula ... 8
Pertumbuhan Cronobacter spp. ... 10
Kinetika Inaktivasi Mikroba dan Ketahanan panas Cronobacter spp. ... 11
Faktor yang Mempengaruhi Ketahanan Panas... 16
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ... 19
Bahan dan Alat ... 19
Metodologi Penelitian ... 20
Penentuan Parameter Kinetika Inaktivasi Isolat Cronobacter spp. ... 21
Pengaruh aw dan pH pada Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp. dalam Sistem Bufer ... 23
HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian Pendahuluan dalam Menentukan Waktu Tunda. ... 25
Kinetika Inaktivasi Isolat Cronobacter spp ... 26
Nilai Z untuk Isolat Lokal Cronobacter spp ... 30
Perbandingan Nilai D ... 32
Perbandingan Nilai Z Beberapa Galur Cronobacter spp. ... 36
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Penamaan kembali beberapa galur Cronobacter spp. ... 6
2 Nilai D dan nilai Z untuk berbagai galur Cronobacter spp. ... 15
3 Daftar isolat Cronobacter spp. yang digunakan. ... 20
4 Nilai D untuk berbagai galur Cronobacter spp. ... 28
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Cronobacter sakazakii(SEM x4800) ... 5
2 Logaritma jumlah mikroba terhadap waktu yang digunakan untuk
menentukan nilai D.. ... 13 3 Penentuan nilai Z dari hubungan log D terhadap suhu ... 14 4 Diagram alir penelitian. ... 21 5 Penentuan waktu tunda hingga mencapai suhu 54 C... 26 6 Bahu yang terbentuk pada pada ketahanan panas Cronobacter spp.
isolat DES b10 pada suhu 54 C ... 26
7 Kinetika inaktivasi isolat DES b10 pada suhu 54 C. ... 27 8 Hubungan log nilai D dengan suhu untuk isolat lokal dari susu formula ... 30 9 Hubungan log nilai D dengan suhu untuk isolat lokal dari makanan bayi .... 31 10 Hubungan log nilai D dengan suhu untuk isolat lokal dari maizena dan
bubuk coklat ... 32
11 Nilai D52 C berbagai isolat Cronobacter spp. dalam menstruum susu
formula ... 33
12 Nilai D54 C berbagai isolat Cronobacter spp. dalam menstruum susu
formula. ... 34
13 Nilai D56 C berbagai isolat Cronobacter spp. dalam menstruum susu
formula. ... 35 14 Nilai D58 C berbagai isolat Cronobacter spp. dalam menstruum susu
formula. ... 36 15 Hubungan log nilai D log nilai D dengan suhu untuk Cronobacter spp.
asal susu formula.. ... 37 16 Hubungan log nilai D dengan suhu untuk Cronobacter spp. asal klinis ... 39 17 Hubungan antara aw dan log D56 C untukisolat YR t2a pada larutan NaCl
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Sistem bufer Mcilvaine pada berbagai aw ... 51
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang, peritrichous, bersifat motil, termasuk ke dalam keluarga Enterobacteriaceae, dan dilaporkan menjadi penyebab beberapa kasus infeksi meningitis, septicemia, dan necrotizing enterocolitis (NEC). Sebagian besar kasus terjadi pada bayi prematur dengan usia kurang dari 28 hari atau bayi lahir dengan bobot badan rendah (< 2500 g) yang diduga memiliki respon imun yang rendah dibandingkan bayi normal atau orang dewasa (Dancer & Kang 2009).
Saat ini dilakukan penamaan kembali Enterobacter sakazakii menjadi
Cronobacter spp. dalam upaya klasifikasi ulang taksonomi E. sakazakii menjadi satu genus baru yaitu Cronobacter spp. dikarenakan keragaman antara isolat-isolat yang telah diperoleh peneliti-peneliti di beberapa negara (Iversen et al. 2007a; 2007b; 2008). Klasifikasi ulang taksonomi E. sakazakii berdasarkan karakterisasi molekuler terhadap gen 16S rRNA, gen dna G, dan glu A. Selain itu pengujian biokimia (API20E, ID32E) termasuk uji -glukosidase, pembentukan pigmen kuning, dan pertumbuhan pada media kromogenik.
Genus Cronobacter spp. yang diusulkan terdiri atas 5 spesies yaitu C.
sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii, dan C. dublinensis sedangkan 2 galur Cronobacter tampaknya menjadi genomospecies terpisah dan dimasukkan sebagai Cronobacter genomospecies I. Genomospecies ini belum terkait dengan biogroup spesifik. Sejumlah subspesies Cronobacter dublinensis
diantaranya Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov., Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp.nov., dan Cronobacter dublinensis subsp.
lactaridi subsp. nov. (Iversen et al. 2008).
Kontaminasi Cronobacter spp. pada susu formula bayi terjadi pada tahap produksi dan penyajian. Tahap produksi disebabkan penambahan ingridien pada saat pencampuran kering, pengeringan, atau pengemasan susu. Tahap penyajian dikarenakan kontaminasi Cronobacter spp. dalam persiapan peralatan pembuatan susu seperti botol, sikat, dan sendok. Kontaminasi selama rekonstitusi susu formula bayi diduga menjadi modus terjadinya kasus infeksi Cronobacter spp (Al-Holy et al. 2008).
Informasi mengenai parameter kinetika inaktivasi mikroba berupa nilai D dan Z berguna untuk merancang proses pasteurisasi sehingga berperan dalam mengontrol proses pengukuran. Nilai D merupakan waktu yang diperlukan untuk menurunkan mikroba tertentu sebesar 90% atau 1 siklus log pada suhu tertentu dan Z adalah perubahan suhu yang diperlukan untuk mengubah nilai D sebesar 90% atau 1 siklus log. Inaktivasi panas biasanya dirancang untuk meningkatkan umur simpan suatu produk tetapi inaktivasi terhadap bakteri patogen sangat penting terhadap keamanan suatu produk.
Beberapa peneliti telah melaporkan nilai D dan Z Cronobacter spp. diantaranya oleh Nazarowec-White dan Farber (1997) terhadap 5 isolat klinis, 5 isolat pangan, dan 10 isolat gabungan pada menstruum susu formula. Lima isolat klinis dengan nilai D54 C 36.72±6.07 menit, D56 C 310.91±01.52 menit,
D58 C 5.45±0.46 menit, dan D60 C 3.06±0.12 menit. Lima isolat pangan dengan
nilai D54 C 18.57±1.14 menit, D56 C 9.75±0.47 menit, D58 C 3.44±0.35 menit, dan
D60 C 2.15±0.07 menit. Sepuluh isolat gabungan dengan nilai D54 C 23.70±2.25
menit, D56 C 10.30±0.72 menit, D58 C 4.20±0.57 menit, dan D60 C 2.50±0.21 menit. Nilai Z untuk 5 isolat klinis, 5 isolat pangan, dan 10 isolat gabungan adalah 6.02 C, 5.60 C, dan 5.82 C.
Nilai D dan Z isolat lokal Cronobacter spp. telah dilaporkan oleh Ardelino (2011) yaitu YR t2a, YR c3a, dan E9 dengan menstruum susu formula. Isolat YR t2a mempunyai nilai D54 C 7.75±0.08 menit, D56 C 3.61±0.12 menit, D58 C
1.16±0.04 menit, dan D60 C 0.90±0.03 menit. Isolat YR c3a mempunyai nilai
D54 C 9.13±1.23 menit, D56 C 3.83±0.33 menit, D58 C 1.38±0.03 menit, dan D60 C
0.89±0.02 menit. Isolat E9 mempunyai nilai D54 C 7.50±0.28 menit, D56 C
untuk YR t2a, YR c3a, dan E9 adalah 6.08±0.08 C, 5.08±0.43 C, dan
5.54±0.02 C (Ardelino 2011).
Informasi mengenai parameter kinetika inaktivasi Cronobacter spp. masih sangat terbatas terutama isolat lokal Cronobacter spp. yang diisolasi dari beberapa produk susu formula dan makanan bayi lokal. Oleh karena itu pada penelitian ini akan menentukan nilai D dan Z untuk 8 isolat yaitu isolat lokal 7 Cronobacter
spp. dan 1 Enterobacter sakazakii ATCC 51329 (Cronobacter muytjensii). Dari 8 isolat ini, sebanyak 3 isolat yaitu YR c3a, YR t2a, dan ATCC 51329 telah ditentukan nilai D dan Z oleh Ardelino (2011) tetapi pada penelitian Ardelino (2011) tidak mempertimbangkan adanya waktu tunda, pendinginan cepat, dan penambahan suplemen. Selain itu metode yang digunakan oleh Ardelino (2011) berbeda dengan yang digunakan pada penelitian ini. Penelitian ini pun akan melihat pengaruh aw dan pH terhadap inaktivasi Cronobacter spp. selama proses pemanasan. Informasi-Informasi ini sangat penting sehingga resiko kontaminasi produk oleh Cronobacter spp. dapat diminimalkan.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari (1) kinetika inaktivasi
Cronobacter spp. lokal selama proses pemanasan pada susu formula dan (2) pengaruh aktivitas air (aw) dan pH terhadap laju inaktivasi satu isolat Cronobacter spp lokal dalam sistem bufer.
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)
Karakteristik Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)
Enterobacter sakazakii adalah anggota dari famili Enterobacteriaceae, genus
Enterobacter (Nazarowec-White & Farber 1997a). Bakteri ini merupakan bakteri Gram negatif, tidak membentuk spora, berbentuk batang, bersifat anaerob fakultatif, sel motil dengan flagela peritrichous, serta memiliki ukuran dengan panjang 3 µm dan lebar 1 µm (Shaker et al. 2007; Adams & Moss 2000; Erickson & Kornacki 2009; Kandhai 2010). Enterobacter sakazakii pertama kali dideskripsikan sebagai Enterobacter cloacae berpigmen kuning. Perbedaan antara
E. sakazakii dan E. cloacae berdasarkan perbedaan dalam reaksi biokimia, kemampuan koloni E. sakazakii untuk memproduksi pigmen kuning, kerentanan antibiotik, dan hibridisasi DNA-DNA (Farmer et al. 1980; Hassan et al. 2007). Hasil pengamatan menggunakan scanning electron microscopic (SEM x4800) terhadap C. sakazakii ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1 Cronobacter sakazakii(SEM x4800) (Kunkel 2009).
Ada usulan penamaan kembali Enterobacter sakazakii menjadi
Cronobacter spp. pada tahun 2007. Genus baru Cronobacter terdiri atas
setidaknya lima genomospecies, termasuk tiga subspesies. Klasifikasi terbaru
Cronobacter gen. nov. telah diidentifikasi berdasarkan pada pendekatan
taksonomi polyphasic, menggunakan full-length sekuen gen 16S rRNA,
ribotyping, fluorescent amplified fragment length polymorphism (f-AFLP) dan
Berdasarkan pendekatan dan perbedaan profil fenotipik, spesies
Cronobacter sekarang dibagi dalam 16 biogroup. Berikut pembagian 5 spesies
Cronobacter: (1) Cronobacter sakazakii gen. nov., comb. nov. (Biogroup 1-4, 7,
8, 11 dan 13), (2) Cronobacter malonaticus sp. nov. (Biogroup 5, 9, 14), (3)
Cronobacter dublinensis sp. nov. (Biogroup 6, 10, 12), (4) Cronobacter
muytjensii sp. nov. (Biogroup 15), serta (5) Cronobacter turicensis sp. nov.
(Biogroup 16). Dua galur Cronobacter tampaknya menjadi genomospecies
terpisah dan dimasukkan sebagai Cronobacter genomospecies I. Genomospecies
ini belum terkait dengan biogroup spesifik. Sejumlah subspesies Cronobacter
dublinensis diantaranya Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov.
(Biogroup 12), Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp.nov.
(Biogroup 10), dan Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov.
(Biogroup 6) (Iversen et al. 2008, Kandhai 2010). Tabel 1 memberikan daftar nama baru Cronobacter spp.
Tabel 1 Penamaan kembali beberapa galur Cronobacter spp.
Taksonomi galur lama dan kode koleksi kultur Taksonomi galur baru
Enterobacter sakazakii NCTC 8155 Cronobacter sakazakii
Enterobacter sakazakii NCTC 9238 Cronobacter sakazakii
Enterobacter sakazakii NCTC 11467 = ATCC
29544 = DSM 4485 Cronobacter sakazakii
Enterobacter sakazakii NCTC 9844 Cronobacter dublinensis
Enterobacter sakazakii NCTC 9846 Cronobacter dublinensis
Enterobacter sakazakii NCTC 9529 Cronobacter genomospecies 1
Enterobacter sakazakii DSM 18705 Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis
Enterobacter sakazakii ATCC 51329 Cronobacter muytjensii
Enterobacter sakazakii DSM 18703 Cronobacter turicensis
Enterobacter sakazakii DSM 18702T Cronobacter malonaticus
Enterobacter sakazakii DSM 18706T Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis
Enterobacter sakazakii DSM 18707T Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi
Enterobacter sakazakii MC10 Cronobacter spp.
Enterobacter sakazakii MM9 Cronobacter spp.
Iversen et al. 2008; Kandhai 2010
oportunistik yang menyebabkan penyakit parah pada bayi seperti necrotizing enterocolitis (peradangan saluran cerna), septicemia (infeksi berat), dan neonatal
meningitis (menginfeksi selaput otak bayi) (Pyo Kim et al. 2007; Al-Holy 2008).
Sumber KontaminasiCronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)
Cronobacter spp. dilaporkan telah diisolasi dari lingkungan yang berbeda seperti tanah, pabrik susu bubuk, pabrik coklat, rumah tangga, serta dapat diperoleh dari hewan seperti tikus dan serangga (Shaker et al. 2007). Cronobacter
spp. juga telah diisolasi dari berbagai pangan termasuk susu, keju, daging, sayuran, biji sorgum, padi, rempah-rempah, roti fermentasi, minuman fermentasi, tahu, dan teh asam (Shaker et al. 2007; Freidemann 2007).
Beberapa peneliti telah berhasil mengisolasi Cronobacter spp. yang berasal dari makanan lokal diantaranya susu formula, makanan bayi, tepung jagung, bubuk coklat, tepung maizena, dan tepung hunkwee (Dewanti-Hariyadi 2011; Gitapratiwi 2011; Estuningsih 2006; Meutia 2008). Cronobacter spp isolat lokal tersebut telah terdata dibasis data Gen Bank diantaranya 6a (AY624069), 10a (AY 624071), 39a (AY624070), 39d (AY624073), DES c13 (JF800181), DES b10 (JF800179), YR c3a (JF800182), YR t2a (JF800182) (Dewanti-Hariyadi 2011; Gitapratiwi 2011; Estuningsih 2006).
Skladal et al. (1993) menyatakan bahwa Cronobacter spp. merupakan salah satu bakteri kontaminan pada karton susu ultra high temperature (UHT), secara tak langsung bahwa mikroorganisme ini dapat bertahan pada suhu UHT atau kontaminasi setelah proses. Nazarowec-White dan Farber (1997a) melaporkan bahwa 0-12% sampel susu formula bubuk yang ditemukan pada toko pengecer di Kanada (5 perusahan berbeda) telah terkontaminasi Cronobacter spp.. Nazarowec-White dan Farber (1997b) telah mengevaluasi nilai D dari
penyebab wabah dan kasus sporadis dari infeksi Cronobacter spp. (Nazarowec-White & Farber 1997a).
Jika praktek higienis yang rendah digunakan dalam pembuatan dan penanganan susu formula bayi maka jumlah sel bakteri dapat meningkat dengan cepat, hal ini dikarenakan mikroorganisme ini memiliki waktu penggandaan relatif singkat ( 40 menit) pada suhu ruang (Richards et al. 2005).
Nazarowec-White dan Farber (1997b) melaporkan waktu generasi rata-rata 40 menit pada 23 °C dan 5 jam pada 10 °C sedangkan menurut Iversen et al.(2004) Cronobacter
spp. memiliki waktu generasi selama 21 menit pada 37 °C dan 100 menit pada 21 °C. Hal ini menjadi sangat kritis karena Cronobacter spp. memiliki dosis infeksi relatif rendah 1000 CFU/mL pada susu formula bayi yang di rekonstitusi (Iversen & Forsythe 2003).
Pengolahan dan Penyajian Susu Formula
Susu formula bayi digunakan ketika ibu tidak dapat menyusui atau memilih untuk tidak menyusui bayi mereka. Susu pada manusia dan sapi relatif berbeda dari kandungan dan komposisi kimia makronutrien. Oleh karena itu, susu sapi harus dimodifikasi pada tahap produksi agar menyerupai air susu ibu dengan cara (1) mereduksi kadar protein dan mineral (2) meningkatkan jumlah whey protein (3) meningkatkan kadar karbohidrat, dan (4) meningkatkan rasio kalsium/kalium (Ca/P). Selain itu ditambahkan vitamin dan memodifikasi lemak (Nazarowec-white & Farber 1997b).
Produksi susu formula bubuk menggunakan proses yang berbeda antara lain prosedur kering, prosedur basah, atau kombinasi keduanya. Pada prosedur kering, susu skim dipasteurisasi lalu dievaporasi. Semua bahan ingridien yaitu lemak,
whey, vitamin, emulsifier dan stabilisator lalu ditambahkan dan dicampur. Campuran kemudian dipasteurisasi pada 110 C selama 60 detik setelah itu dilakukan spray dryer (pengeringan semprot) (Nazarowec-white & Farber 1997b).
Prosedur basah berupa pencampuran dilakukan dalam keadaan basah sebelum pengeringan sehingga susu skim cair, susu skim sebelum pencampuran, serta komponen lemak diperlakukan pada 80-82 C selama 20 detik kemudian
dipekatkan dengan falling film evaporator. Konsentrat diperlakuan dengan panas kembali pada suhu 80 C dan terakhir dilakukan pengeringan semprot (Nazarowec-white & Farber 1997b). Proses kombinasi dengan cara menghomogenisasi bahan baku lalu dipasteurisasi dan dikeringkan. Setelah itu mencampurkannya dengan ingridien lain berbentuk bubuk kemudian dikemas.
Metode pencampuran kering menimbulkan masalah dari segi kualitas karena komponen kering akan menghasilkan perbedaan ukuran partikel dan densitas sedangkan dilihat dari sudut keamanan, pencampuran ingridien kering dari berbagai sumber menghasilkan banyak kemungkinan kontaminasi, termasuk kontaminasi oleh Cronobacter spp. Bakteri ini terbukti memiliki kemampuan luar biasa untuk bertahan hidup dalam lingkungan yang kering untuk jangka waktu yang lama (~2 tahun) (Richards 2005). Sifat ini memberikan suatu keunggulan kompetitif bagi Cronobacter spp. untuk bertahan dalam lingkungan kering seperti susu formula bubuk karena kemampuan untuk mengakumulasi zat terlarut kompatibel seperti trehalosa, yang berperan dalam melindungi Cronobacter spp. terhadap cekaman osmotik dengan menstabilkan membran fosfolipid dan protein (Breeuwer et al. 2003).
Rekonstitusi susu formula sangat diperlukan karena susu formula merupakan produk non-steril yang harus disiapkan, ditangani, dan disimpan dengan benar. Rekonstitusi dengan air panas berperan untuk menginaktivasi bakteri, termasuk Cronobacter spp.. Biasanya, jumlah Cronobacter spp. yang terdeteksi sangat rendah dalam susu formula bayi bubuk tetapi Cronobacter spp. memiliki kemampuan untuk berkembang biak yang cepat setelah rekonstitusi jika disimpan dalam jangka waktu yang lama pada suhu kamar (Nazarowec-White & Farber 1997b).
Penelitian yang dilakukan oleh Nazarowec-White dan Farber (1997a) menunjukkan bahwa suhu pemanasan 60 C dapat mereduksi jumlah Cronobacter
spp. sebanyak 1.3 log CFU/mL dan pada suhu yang lebih tinggi (80-100 C) dapat mereduksi sebesar 4 log CFU/mL. Sementara itu penelitian Meutia et al. (2009) terhadap ketahanan Cronobacter spp. dalam susu formula yang direkontitusi dengan air bersuhu 4 C dan 40 C tidak banyak mengurangi jumlah Cronobacter
2.74-6.27 log CFU/mL. Akan tetapi rekonstitusi dengan air bersuhu 100 C menginaktivasi Cronobacter spp. hingga jumlah yang tidak terdeteksi. Air pada suhu tinggi dapat menyebabkan beberapa kerugian yang berhubungan dengan kandungan gizi pada susu formula untuk bayi, terutama hilangnya vitamin C (FAO/WHO 2004). WHO/FAO (2007) merekomendasikan penggunaan air pada 70 C untuk merekonstitusi susu formula bayi untuk menginaktivasi kemungkinan kontaminasi Cronobacter spp. dalam susu formula dengan masih memperhatikan nilai gizi.
Pertumbuhan Cronobacter spp.
Cronobacter spp. dapat tumbuh pada media agar selektif untuk organisme enterik seperti MacConkey, Eosin Methylene Blue, Deoxycholate Agar, serta pada media chromogenic selektif yaitu agar Druggan-Forsythe-Iversen (DFI). Selain itu Cronobacter spp. dapat tumbuh pada media nonselektif seperti Tryptic Soy Agar (TSA). Beberapa kaldu selektif dilaporkan menghambat pertumbuhan bagi beberapa galur Cronobacter spp., sebanyak 3 dari 70 galur yang diperoleh dari berbagai sumber tidak dapat tumbuh dalam kaldu lauril sulfat atau kaldu brilliant green bile yang diinkubasi pada suhu antara 7 dan 57 C selama 48 jam, meskipun viabilitasnya telah dikonfirmasi dalam Tryptic Soy Agar (Iversen et al.
2004). Penelitian lain menujukkan bahwa dari 99 galur Cronobacter spp. yang diinkubasi selama 48 jam pada suhu 30 dan 45 C kemudian diamati pada panjang gelombang 620 nm menunjukkan optical density (OD) lebih besar dari 0.1 yang dikarakterisasi sebagai pertumbuhan maksimum.
Medium kaldu selektif akan berpengaruh terhadap pertumbuhan
Cronobacter spp. dengan cara mengganggu proses metabolisme karbohidrat, terutama bila diinkubasi pada suhu tinggi. Cronobacter spp. yang diinokulasikan pada kaldu lauryl sulfate tryptose dan kaldu brilliant green bile setelah diinkubasi pada suhu 37 C menunjukkan fermentasi laktosa masing-masing sebesar 80 %
pertumbuhan dalam kaldu lauryl sulfate tryptose (LST) pada suhu 47 C selama 24 jam.
Pertumbuhan optimum dari Cronobacter spp. dipengaruhi oleh suhu.
Cronobacter spp. mampu tumbuh pada rentang suhu antara 8 hingga 47 C (Kandhai et al. 2006). Suhu pertumbuhan optimum antara 37 sampai 43 C bergantung pada media pertumbuhan (Iversen et al. 2004). Selain media pertumbuhan, galur berpengaruh terhadap pertumbuhan Cronobacter spp.. Hal ini dikarenakan dari 70 galur yang diinokulasikan dalam media TSB selama 24 jam pada suhu 47 C tidak satu pun menunjukkan pertumbuhan tetapi setelah waktu inkubasi diperpanjang selama 48 jam menunjukkan pertumbuhan sebesar 37%.
Penelitian terbaru melaporkan kemampuan Cronobacter spp. dapat bertahan hidup pada lingkungan dengan aktivitas air (aw) sangat rendah, tetapi aktivitas air minimum untuk pertumbuhan Cronobacter spp. belum diketahui. Breeuwer et al. (2003) melaporkan bahwa empat galur Cronobacter spp. dapat tumbuh pada kaldu Brain Heart Infusion (BHI) dengan aw 0.96, pengaturan aw tersebut dilakukan dengan penambahan natrium klorida (NaCl) 1.2 M. Guillaume-Gentil
et al. (2005) melaporkan bahwa 99 galur yang diuji mampu tumbuh dalam kaldu
lauryl sulfate tryptose yang mengandung NaCl 0.5 M. Informasi mengenai pertumbuhan pada aw rendah sangat penting bagi keberlangsungan hidup
Cronobacter spp..
Pertumbuhan dalam lingkungan pH rendah memungkinkan Cronobacter
spp. untuk bertahan pada produk asam atau bertahan hidup dengan kondisi asam lambung. Empat galur dilaporkan dapat tumbuh antara pH 4.5 dan 10.0 pada kaldu BHI (Breeuwer et al. 2003). Dancer et al. (2009) melaporkan bahwa pH minimum untuk pertumbuhan pada 37 C selama 24 jam adalah 3.9 atau 4.1 untuk banyak galur yang telah diuji.
Kinetika Inaktivasi Mikroba dan Ketahanan panas Cronobacter spp.
coba, peraturan, atau pengalaman. Penilaian kecukupan panas dapat diperkirakan berdasarkan reduksi log bakteri melalui konsep nilai D dan Z. Akan tetapi ketahanan panas dari setiap galur Cronobacter spp. berbeda-beda (Edelson-Mammel & Buchanan 2004).
Waktu reduksi desimal menunjukkan waktu yang diperlukan untuk membunuh sejumlah mikroba pada suhu spesifik dalam jangka waktu tertentu. Prosedur untuk menentukan waktu reduksi desimal adalah menempatkan sejumlah sel atau spora yang diketahui jumlahnya pada tabung kapiler yang disegel.
Selanjutnya dipanaskan hingga waktu yang telah ditentukan (misalnya, setiap 1 menit) kemudian tabung diangkat, didinginkan, dan kemudian dilakukan
penentuan jumlah sel yang hidup. Setelah perlakuan akan didapatkan jumlah sel hidup pada setiap waktu pemanasan dengan demikian pada kurva dapat diplot jumlah sel yang hidup terhadap waktu. Hasil plot ini akan diperoleh waktu reduksi desimal.
Waktu reduksi desimal (nilai D) untuk organisme target, dihitung dengan menggunakan kinetika inaktivasi orde satu untuk model kurva ketahanan sel vegetatif atau spora (Tucker et al. 2001). Nilai D merupakan waktu pemanasan (menit) untuk mereduksi mikroorganisme berupa sel vegetatif atau spora sebanyak 1 unit log (pengurangan populasi 90%) pada suhu, medium, dan galur mikroba tertentu (Ramesh 2003; Tang et al 2000). Sebagai contoh, nilai D dari
C. botulinum pada 240 °F dengan media beras spanyol pada pH 4.6 adalah 0.21 menit. Semakin tinggi nilai D menunjukkan bahwa semakin tahan mikroba dengan inaktivasi panas bila dibandingkan dengan mikroba lain pada kondisi pemanasan yang sama (Fung 2009).
Laju inaktivasi mikroba selama waktu pemanasan pada suhu konstan, dengan N0 adalah jumlah awal dari populasi mikroba dan N(t) jumlah mikroba setelah waktu pemanasan t. Menurut model kinetika orde pertama, dalam kondisi isotermal (T=konstan), laju inaktivasi dN (t)/dt adalah:
atau
Persamaan (1.3) menunjukkan plot kurva semilogaritma dari N terhadap t. Persamaan tersebut dapat diubah menjadi persamaan (1.4)
atau
Nilai kemiringan 2.303/k, sering dinyatakan sebagai nilai D sehingga:
Plot logaritma dari jumlah mikroba terhadap waktu pada suhu tertentu dapat dilihat pada Gambar 2 yang digunakan untuk menentukan nilai D. Gambar 2 merupakan bentuk kurva semilogaritma, yang memiliki kemiringan (slope) -1/D, persamaan kurva yang diberikan
Nilai Z yaitu perubahan suhu yang diperlukan untuk mengubah nilai D sebesar 90% atau 1 siklus (Toledo 2007). Nilai Z dihitung dengan menggunakan hubungan orde satu untuk model hubungan antara nilai Ddan suhu pemanasan, yang diperoleh dari plot log D terhadap suhu (Gambar 3). Persamaan untuk plot D/Z diberikan dalam persamaan:
dengan DT adalah nilai D pada suhu tertentu (menit), Dref adalah nilai D pada suhu
standar (refrensi), T adalah pemanasan pada suhu tertentu ( C), dan Tref adalah suhu standar yang digunakan untuk nilai D0. Nilai Z memberikan informasi mengenai ketahanan relatif dari mikroorganisme pada suhu pemanasan yang berbeda. (van Asselt & Zwietering 2005).
Gambar 3 Penentuan nilai Z dari hubungan log D terhadap suhu (Holdsworth et al. 2004).
.
satu galur khusus yang tahan panas bertanggung jawab terhadap tingginya nilai D
5 clinical isolates 36.72±6.07 10.91±1.52 5.45±0.46 3.06±0.12 6.02 Nazarowec-White & Farber 1997
5 food isolates 18.57±1.14 9.75±0.47 3.44±0.35 2.15±0.07 5.60 Nazarowec-White & Farber 1997
10 pooled isolates 23.70±2.52 10.30±0.72 4.20±0.57 2.50±0.21 5.82 Nazarowec-White & Farber 1997
ATCC 51329 n.t. n.t. 0.51±0.00 n.t. n.t. Edelson-Mammel &
YR t2a, YR c3a, dan E9 pada suhu 54 C, berturut-turut adalah 7.75±0.08, 9.13±1.23, dan 7.50±0,28 menit. Isolat YR t2a dan YR c3a asal formula bayi memiliki nilai D54 C yang lebih besar dibandingkan dengan isolat E9 asal makanan bayi (Ardelino 2011).
Nilai D pada suhu 58 C untuk isolat lokal Cronobacter spp. berkisar antara 1.34-1.39 menit. Nilai D58 C terbesar ditemukan pada isolat asal makanan bayi E9
yaitu sebesar 1.39 menit sementara nilai D58 C terkecil ditemukan pada isolat YR
t2a sebesar 1.34±0.03 menit. Nilai D58 C untuk isolat YR c3a adalah 1.38±0.03
menit. Nilai D58 C untuk isolat asal susu formula atau makanan bayi tidak jauh berbeda (Ardelino 2011).
Nilai Z untuk isolat ATCC 51329 bernilai 5.65±0.23 C, isolat YR t2a
benilai 6.08±0.08 C, isolat YR c3a bernilai 5.80±0.43 C, dan isolat E9 bernilai
5.54±0.02 C. Isolat ATCC 51329 memiliki nilai D60 C sebesar 0.82 menit dengan
nilai Z sebesar 5.65±0.23 C. Untuk menurunkan nilai D hingga 0.082 menit
diperlukan kenaikan suhu sebesar 5.65 C. Hal ini berarti nilai D sebesar 0.082
menit dapat tercapai pada suhu 65,65 C (Ardelino 2011).
Faktor yang Mempengaruhi Ketahanan Panas
Sejumlah faktor mempengaruhi ketahanan panas dari mikroba yaitu, aktivitas air (aw), pH, dan komposisi pangan (Holdsworth et al. 2004). Selain itu perbedaan galur mikroba, kondisi fisiologi dari mikroba, suhu inkubasi,
menstruum pemanas, metode yang digunakan, dan metodologi dalam menyembuhkanmikroba (Kim & Park 2007).
Aktivitas air (aw) yang tinggi pada produk pangan biasanya tidak mempengaruhi ketahanan panas mikroba akan tetapi produk bubuk kering atau produk yang berlemak menyebabkan ketahanan panas mikroba menjadi lebih tinggi. Hal yang sama pada pemanasan langsung dengan uap, uap panas kering kurang efektif untuk inaktivasi mikroba (Holdsworth et al. 2004).
pasteurisasi yang diperlukan untuk menstabilkan produk. Untuk pH>4,5 misalnya, pada sayuran, ikan, dan produk daging, proses harus terrencana untuk menonaktifkan spora Clostridium botulinum (Holdsworth 2004).
Berbagai menstruum yang digunakan dalam pengujian ketahanan panas
Cronobacter spp. diantaranya susu formula, susu skim, makanan bayi, larutan garam, tryptic soy broth (TSB), dan bufer fosfat. Menstruum susu formula, susu skim, atau makanan bayi memiliki efek proteksi mikroba terhadap panas karena adanya kandungan lemak, protein, karbohidrat, konsentrasi gula, dan jumlah padatan sehingga meningkatkan ketahanan panas.
Fase pertumbuhan mikroba berpengaruh terhadap ketahanan panas mikroba pada proses pemanasan. Fase pertumbuhan mikroba diantaranya fase eksponensial, pada fase ini sel mikroba paling sensitif terhadap kondisi lingkungan seperti kekeringan, panas, dingin, dan bahan kimia. Fase stasioner menyebabkan sel lebih tahan terhadap kondisi lingkungan (Breeuwer et al. 2003). Selain itu jumlah isolat yang diinokulasikan berpengaruh terhadap ketahanan panas. Beberapa peneliti menggunakan jumlah inokulum Cronobacter spp. yang berbeda. Kim dan Park (2007) menggunakan jumlah inokulum 106 CFU/mL, Breeuwer et al. (2003) menggunakan jumlah inokulum 107 CFU/mL, Ardelino (2011) dengan jumlah isolat 108 CFU/mL sedangkan Nazarowec-White dan Farber (1997b) dengan jumlah isolat 109 CFU/mL.
Metode yang digunakan untuk pengujian ketahanan panas berbeda-beda diantaranya menggunakan metode tabung kaca disegel (Tabung TDT), tabung kapiler, kaleng TDT, dan submerged coil. Metode tabung TDT dengan cara suspensi mikroba diinjeksikan kedalam tabung kaca Pyrex (diameter luar 7-9 mm) kemudian dipanaskan dalam water bath, oil bath atau sistem biological indicator-evaluation resistometer (BIER) (Pflug & Gound 2000).
Metode kaleng TDT mempunyai diameter berukuran 2.5 inci (63.3 mm) dan tinggi 0.375 inci (9.52 mm). Metode ini digunakan untuk produk padat atau produk suspensi cairan (Pflug & Gound 2000; Kusnandar et al. 2006). Metode
submerged coil, dengan cara suspensi mikroba diinjeksikan secara cepat sebelum pemanasan, kumparan logam dengan diameter kecil kemudian dicelupkan hingga mencapai prakesetimbangan saat dipanaskan dalam water bath sehingga waktu pemanasan terjadi secara cepat. Jarum suntik otomatis akan menggantikan sampel pada interval yang telah ditentukan. Keuntungan dari metode ini adalah proses sampling yang sangat cepat (Pflug & Gound 2000).
Metode yang digunakan oleh setiap peneliti untuk menguji ketahanan panas
Cronobacter spp. berbeda-beda diantaranya, Kim dan Park (2007) menggunakan metode tabung sentrifus kaca yang berisi 19 mL susu formula. Nazarowec-White dan Farber (1997b) menggunakan metode tabung sentrifus dari stainless steel
(ujung berbentuk datar) berisi 49.5 mL susu formula yang digunakan untuk mengevaluasi ketahanan panas isolat gabungan Cronobacter spp. yang direkontitusi pada susu formula. Edelson-Mammel dan Bunchanan (2004) menentukan ketahanan panas menggunakan submerged coil apparatus untuk mengevaluasi efek dari rehidrasi susu formula bubuk dengan suhu yang berbeda. Breeuwer et al. (2003) menggunakan tabung kapiler yang berisi 10 µL suspensi sel untuk menguji ketahanan panas Cronobacter spp. Selain itu Ardelino (2011) menggunakan metode Erlenmeyer Pyrex 50 ml (diameter 51 mm dan tinggi 78 mm) berisi 9 mL susu formula yang digunakan untuk uji ketahanan panas isolat lokal Cronobacter spp..
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April 2011 hingga November 2011. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST IPB dan Laboratorium Pengolahan ITP Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah 8 isolat Cronobacter spp. yaitu DES b10 (JF800179), DES c13 (JF800181), DES b7a, DES d3, YR t2a (JF800182), YR c3a (JF800182), 6a (AY624069), dan ATCC 51329 (AY752937) yang berasal dari susu formula, tepung maizena, bubuk coklat, dan makanan bayi (Tabel 3). Media pertumbuhan berupa Tryptic Soy Agar Yeast Extract (TSAYE) (TSA, Oxoid CM0131). Media kultur menggunakan Brain Heart Infusion Broth
(BHIB, Oxoid CM0225). Menstruum susu formula bayi digunakan untuk mengkaji ketahanan panas isolat Cronobacter spp. Buffered Peptone Water
(BPW, Oxoid CM0509) digunakan untuk pengenceran. HCl dan NaOH digunakan untuk mengatur pH bufer Mcllvaine. Bufer Mcllvaine ditambahkan dengan NaCl atau sukrosa digunakan untuk mengatur aw.
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah tabung TDT yang terbuat dari gelas Pyrex dengan panjang 150 mm, diameter dalam (ID) 7 mm, dan diameter luar (OD) 9 mm. Water bath (Seri A07101004), laminar air flow,
Tabel 3 Daftar isolat Cronobacter spp. yang digunakan
Nama isolat Asal isolat Nomor Akses sekuen gen 16S rRNA di Gen Bank
DES b7a Makanan Bayia -
DES b10 Makanan Bayia JF800179
DES c13 Maizenaa JF800181
DES d3 Bubuk Coklata -
YR t2a Susu Formula Bayib JF800182
YR c3a Susu Formula Bayib JF800182
6a Formula Lanjutan Bayic AY624069
ATCC 51329 Klinisd AY752937
a
Dewanti-Haryadi (2011) b
Meutia (2008) c
Estuningsih et al. (2006)
d
Iversen et al. (2004)
Metodologi Penelitian
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan yaitu penelitian pendahuluan untuk menentukan lag time (waktu tunda), penentuan kinetika inaktivasi
Keterangan: *) Penentuan parameter kinetika inaktivasi dilakukan setelah pemanasan mencapai suhu konstan yang diinginkan, yaitu setelah melewati waktu tunda.
Gambar 4 Diagram alir penelitian
Penentuan Parameter Kinetika Inaktivasi Isolat Cronobacter spp.
Kajian kinetika inaktivasi dilakukan pada lima suhu yang berbeda yaitu 50,
52, 54, 56, dan 58 C. Kajian kinetika inaktivasi terdiri atas penentuan waktu tunda, persiapan inokulum, persiapan menstruum pemanas, dan uji kinetika inaktivasi isolat Cronobacter spp. Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut.
Penentuan Waktu Tunda. Waktu dan suhu pengukuran diatur pada alat
thermocouple, waktu pengukuran diatur pada rentang 1 menit sedangkan suhu Penentuan waktu tunda
Penentuan parameter kinetika inaktivasi*) 7 isolat lokal Cronobacter spp dan 1 isolat Cronobacter
muytensii (ATCC 51329) terhadap panas
Ketahanan panas satu isolat lokal dalam sistem bufer (pengaruh aw dan pH pada media perlakuan)
Nilai D pada berbagai aw Nilai D pada berbagai pH
Nilai D Nilai z
pengukuran diatur dalam celsius ( C). Kabel thermocouple diletakkan di tengah tabung TDT yang diisi media susu formula, di samping tabung TDT, dan di rak tabung kemudian alat thermocouple dinyalakan. Tabung TDT yang berisi
menstruum susu formula dan kabel thermocouple lalu dimasukkan dalam water bath pada suhu 50, 52, 54, 56, dan 58 C. Setiap rentang 1 menit maka
thermocouple akan mencetak suhu dari water bath yang mencapai kabel
thermocouple.
Pesiapan Inokulum. Semua isolat yang berada dalam agar miring TSA dipindahkan kedalam BHIB dan ditumbuhkan selama 17 jam pada suhu 37 C sehingga jumlahnya mencapai 108-109 CFU/ml (Permadi 2010).
Persiapan Menstruum Pemanas. Menstruum pemanas yang digunakan dalam kajian kinetika inaktivasi isolat Cronobacter spp. adalah susu formula bayi. Pembuatan susu formula sebagai menstruum pemanas dilakukan dengan mengikuti instruksi penyajian susu seperti yang tertera dalam kemasan, 13.2 gram
susu direkonstitusi dengan 90 ml air bersuhu 70 C. Penggunaan air bersuhu
70 C digunakan untuk mencegah terjadinya kontaminasi susu oleh mikroba. Selanjutnya sebanyak 1.8 mL susu formula yang telah direkonstitusi dimasukkan kedalam Tabung TDT.
Kinetika Inaktivasi Isolat Cronobacter spp. (Lang & Smith 2008).
Kedalam tabung TDT steril yang telah berisi 1.8 mL menstruum ditambahkan dengan 0.2 mL inokulum yang mengandung kultur bakteri Cronobacter spp. sebanyak 108-109 CFU/mL kemudian divorteks setelah itu diletakkan dalam rak tabung. Rak tabung yang berisi tabung TDT kemudian dimasukkan dalam water bath dengan suhu yang konstan yaitu 50, 52, 54, 56, atau 58 C. Pemanasan dilakukan dengan mengkombinasikan suhu dan waktu pemanasan dengan interval waktu yang sudah ditentukan. Setelah kombinasi waktu dan suhu tercapai, tabung TDT dari water bath dengan cepat dipindahkan kedalam wadah berisi es dan air untuk menghentikan proses inaktivasi oleh panas dengan pendinginan cepat.
Pendinginan cepat untuk mencapai 0 C terhadap sampel, dilakukan dalam
waktu 5-6 menit sedangkan untuk memulihkan kembali (resusitasi) dari suhu 0 C
0.1 mL sampel pada cawan berisi TSAYE kemudian diinkubasi pada 37 C selama 24 atau 48 jam (Lang & Smith 2008). Prosedur inaktivasi diulang triplo
untuk setiap kondisi suhu percobaan: 50, 52, 54, 56 dan 58 C.
Perhitungan Koloni (BAM 2001). Perhitungan jumlah koloni dilakukan untuk melihat isolat yang dapat bertahan setelah perlakuan panas. Jumlah koloni yang dihitung berkisar antara 25-250 koloni. Isolat Cronobacter spp. yang terpilih digunakan untuk penentuan kinetika inaktivasi isolat Cronobacter spp.. Jumlah koloni bakteri dapat dihitung dengan rumus standard plate count sebagai berikut:
N = Σ C/[ (1*n1) + (0.1*n2) ] * (d)
Keterangan: N = jumlah koloni per ml atau per gram produk C = jumlah semua koloni yang dihitung dari 2 cawan n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama
n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua d = pengenceran pertama yang dihitung
Perhitungan Nilai D dan Nilai Z. Penurunan jumlah bakteri dikonversi menjadi nilai log Nt/N0 dan diplotkan kedalam kurva semilog pada sumbu y sedangkan sumbu x menunjukkan lama pemanasan (menit) pada suhu konstan yang diujikan, yaitu pada suhu 50, 52, 54, 56 dan 58 C. Selanjutnya dilakukan perhitungan waktu reduksi desimal (nilai D) yaitu -1/kemiringan kurva. Nilai Z dihitung dengan membuat kurva hubungan nilai D tehadap suhu. Kurva tersebut dibuat dengan memplotkan suhu pengujian pada skala aritmatik dan nilai log D pada skala logaritmik. Nilai Z dapat dihitung dari garis lurus yang dihasilkan (Gambar 3).
Pengaruh aw dan pH pada Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp. dalam
Sistem Bufer
bakteri disebar pada media TSAYE lalu diinkubasi selama 24 atau 48 jam pada
suhu 37 C kemudian dihitung jumlahnya. Penurunan jumlah bakteri dikonversi menjadi nilai log Nt/N0 dan diplotkan sebagai sumbu y dan sumbu x menunjukkan lama pemanasan (menit). Nilai D56 C dapat ditentukan dari kemiringan kurva (Gambar 2).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian Pendahuluan dalam Menentukan Waktu Tunda
Waktu tunda pada awal pemanasan akan menyebabkan terbentuknya
shoulder (bahu) sehingga pada kurva kinetika inaktivasi tidak bentuk garis linear. Pengukuran suhu menstruum dalam tabung TDT dengan thermoucouple
menunjukkan bahwa pada menit ke-0 hingga menit ke-2 terjadi kenaikan suhu dari 25.2 C sampai 54.0 C. Pada menit ke-0 hingga menit ke-2 terjadi waktu tunda yaitu waktu yang dibutuhkan untuk mencapai kondisi isotermal. Setelah menit ke-2 menunjukkan kondisi isotermal pada suhu 54 C (Gambar 5).
Bahu pada kurva ketahanan panas biasanya terbentuk pada menit awal (Gambar 6). Sebagai contoh, kurva ketahanan panas isolat DES b10 pada suhu 54 C menunjukkan bahwa pada menit ke-0 hingga ke-2 jumlah bakteri awal relatif tetap, setelah menit ke-2 baru terjadi reduksi jumlah isolat DES b10 (Gambar 6). Bila terbentuknya bahu dihubungkan dengan waktu tunda dapat disimpulkan
bahwa pada 0-2 menit, suhu menstruum belum mencapai 54 C sehingga belum terjadi atau sedikit inaktivasi tehadap jumlah Cronobacter spp. dengan demikian kondisi isotermal suhu 54 C tercapai pada menit ke-2 sehingga analisis penentuan kinetika inaktivasi terhadap tujuh isolat lokal Cronobacter spp. dan satu Enterobacter sakazakii ATCC 51329 (Cronobacter muytjensii) dilakukan pada t=0 yaitu pada menit ke-2. Hasil penelitian menunjukkan pada suhu lain tercapainya kondisi isotermal pada menit ke-2.
Menurut Stringer et al. 2000 didalam van Asselt dan Zwietering 2005, adanya bahu dikarenakan terbatasnya prosedur percobaan, heterogenitas dari populasi, atau adaptasi bakteri terhadap panas selama perlakuan panas. Bahu yang didapatkan pada hubungan loglinear tidak memberikan data inaktivasi yang baik.
Selain waktu tunda, faktor yang berpengaruh terhadap proses penetrasi panas dari water bath ke dalam tabung TDT dalam menginaktivasi Cronobacter
Cronobacter spp. Tabung TDT yang terbuat dari Pyrex memiliki nilai konduktivitas 1.005 W/(m.oC) pada suhu 25 oC. Tabung TDT yang dipakai pada penelitian ini memiliki ketebalan 2 mm.
Gambar 5 Penentuan waktu tunda hingga mencapai suhu 54 C.
Gambar 6 Bahu yang terbentuk pada kurva ketahanan panas Cronobacter spp. isolat DES b10 pada suhu 54 C.
Kinetika Inaktivasi Isolat Cronobacter spp.
muytjensii). Kurva inaktivasi Cronobacter spp. mengikuti model kinetika reaksi orde satu sehingga analisis regresi dapat digunakan untuk memperoleh nilai D. Sebagai contoh disajikan kurva inaktivasi Cronobacter spp. isolat DES b10 pada suhu 54 C, dimana nilai D dapat dihitung dari -1/kemiringan kurva, sehingga diperoleh nilai D maksimumnya adalah 16.00 menit dan nilai D minimumnya adalah 13.05 menit (Gambar 7). Kurva inaktivasi untuk isolat yang lain dan nilai D pada berbagai suhu dihitung dengan menggunakan cara yang sama, dan hasilnya terdapat pada Lampiran 4.
Gambar 7 Kinetika inaktivasi isolat DES b10 pada suhu 54 C.
Hasil perhitungan nilai D maksimum dan minimum untuk setiap isolat pada
suhu 50-58 C disajikan dalam Tabel 4. Penelitian ini menunjukkan bahwa nilai D untuk isolat Cronobacter spp. lokal yang dipelajari berkisar antara 3.61-11.36 menit pada suhu 56 C sampai 68.47-256.41 C menit pada suhu 50 C. Tabel 4
menujukkan bahwa, pada berbagai suhu nilai D untuk isolat 6a, YR t2a, dan YR c3a lebih besar jika dibandingkan dengan nilai D untuk isolat yang lain.
Ketiga isolat tersebut berasal dari susu formula, dengan YR t2a dan YR c3a yang secara sekuen parsial gen 16S rRNA dapat digolongkan sebagai spesies yang sama (Gitapratiwi 2012). Nilai D isolat 6a paling besar dibandingkan isolat yang lain pada suhu 50, 52, dan 58 C. Isolat YR t2a memiliki nilai D paling besar pada
Tabel 4 Nilai D berbagai galur Cronobacter spp.
nilai D (menit)
Media Galur 50 C (min-maks) 52 C (min-maks) 54 C(min-maks) 56 C(min-maks) 58 C(min-maks)
Susu
formula DES b7a 104.17-117.65 33.00-49.75 20.00-25.32 5.40-8.55 1.72-1.90
DES b10 69.44-111.11 34.60-66.22 13.05-16.00 4.04-5.48 2.65
DES c13 84.03-117.65 17.92-49.50 16.39-20.12 6.06-11.36 2.55
DES d3 68.97-79.36 49.50-64.93 16.92-22.07 3.45-3.73 -
YR t2a 119.05-169.40 43.10-80.00 31.64-33.67 5.83 -
YR c3a 103.09-243.90 35.84-46.73 21.41-21.74 3.61-4.10 -
6a 200-256.41 87.72-114.94 26.81-30.55 8.79-9.73 3.04-3.55
ATCC 104.17-172.41 68.03-83.33 13.64-17.24 9.0-9.9 -
Dari delapan isolat yang dipelajari pada penelitian ini, tiga isolat diantaranya telah dilaporkan nilai D-nya oleh oleh Ardelino (2011). Ketiga isolat yang telah dilaporkan nilai D-nya adalah ATCC 51329, YR t2a, dan YR c3a akan tetapi nilai D tersebut berbeda dengan yang diperoleh dalam penelitian ini. Nilai
D pada penelitian Ardelino (2011) untuk ATCC 51329 pada suhu 54 dan 56 C
adalah 8.66±0.16 menit dan 4.1±0.10 menit. YR t2a pada suhu 54 dan 56 C
adalah 7.75±0.08 menit dan 3.61±0.12 menit. YR t2a pada suhu 54 dan 56 C adalah 7.50±0.28 menit dan 4.24±0.05 menit sedangkan nilai Z untuk isolat ATCC 51329, YR t2a, dan YR c3a adalah 5.65±0.23 C, 6.08±0.08 C dan
5.80±0.43 C Nilai D pada penelitian Ardelino (2011) lebih kecil bila dibandingkan dengan nilai D pada penelitian ini (Tabel 4).
Perbedaan nilai D dikarenakan perbedaan metode yang digunakan. Pada penelitian Ardelino (2011) menggunakan Erlenmeyer Pyrex 50 mL (diameter 51 mm dan tinggi 78 mm) sedangkan penelitian ini memakai tabung TDT dari gelas Pyrex (panjang 150 mm, diameter dalam 7 mm, dan diameter luar 9 mm). Walaupun kedua metode ini menggunakan gelas Pyrex dengan nilai konduktivitas yang sama yaitu 1.005 W/(m.oC) pada suhu 25 oC tetapi ketika dipanaskan dalam
water bath, penetrasi panas lebih seragam pada tabung TDT dibandingkan Erlenmeyer. Penelitian Ardelino (2011) tidak mempertimbangkan adanya waktu tunda sehingga nilai D yang diperoleh kurang akurat. Data yang kurang akurat
Penelitian ini menunjukkan bahwa kondisi isotermal tercapai pada menit ke-2 sehingga t=0 pada menit ke-2. Selain itu pada penelitian ini setelah pemanasan dilakukan pendinginan cepat yang berperan untuk menghentikan penetrasi panas dari menstruum susu formula terhadap Cronobacter spp. sedangkan penelitian Ardelino (2011) tidak ada pendinginan cepat sehingga lebih banyak Cronobacter
spp. yang mati. Hal ini yang menyebabkan nilai D pada penelitian Adelino (2011) menjadi lebih kecil. Pada penelitian ini, media TSA ditambah dengan 0.6% yeast extract. Yeast extract berperan untuk memperbaiki kerusakan subletal pada
Cronobacter spp. yang disebabkan oleh pemanasan (Arroyo 2009). Akan tetapi penelitian Ardelino (2011) tanpa penambahan yeast extract sehingga Cronobacter
spp. tidak membentuk koloni yang dapat dihitung pada media TSA. Oleh karena itu nilai D pada penelitian Ardelino menjadi lebih kecil.
Cronobacter spp. dapat tumbuh pada rentang suhu antara antara 8 hingga 47 C (Kandahi et al. 2006) sehingga pemanasan pada suhu 50 C menyebabkan masih banyak Cronobacter spp. yang bertahan dan membentuk koloni pada media TSAYE. Cronobacter spp. yang bertahan akan menyebabkan nilai D menjadi besar. Selain itu pemanasan pada suhu 45-50 C menyebabkan mikroba memproduksi heat shock protein (Hsps) untuk mencegah kerusakan sel akibat denaturasi protein, sehingga Cronobacter spp. menjadi lebih tahan terhadap perlakuan panas atau peningkatan suhu (Arroyo et al. 2009; Wan-Ling et al.
2010).
ini ditambakan yeast extract sebanyak 0.6% yang berperan untuk menyembuhkan sel setelah terjadinya stres oleh panas.
Nilai Z untuk Isolat Lokal Cronobacter spp
Gambar 8 menunjukkan hubungan antara log nilai D dan suhu untuk isolat lokal Cronobacter spp. yang berasal dari susu formula yakni YR c3a, YR t2a, dan 6a. Isolat 6a paling tahan panas dibanding isolat lain yang berasal dari susu formula pada berbagai suhu. Bila dilihat dari kemiringannya, hubungan antara log nilai D dan suhu pemanasan untuk isolat 6a hampir sejajar dengan isolat YR t2a. Akan tetapi kemiringanuntuk isolat YR c3a lebih curam. Bentuk kemiringan yang curam menunjukkan bahwa isolat ini lebih sensitif terhadap perubahan suhu (Gambar 8). Bila dilihat dari nilai Z, isolat 6a dan YR t2a memiliki nilai Z yaitu 4.18-4.31 C dan 4.20-4.92 C sedangkan isolat YR c3a memiliki nilai Z yaitu
3.54-4.36 C. Walaupun isolat YR t2a dan YR c3a berada dalam sub-klaster yang sama tetapi nilai Z-nya berbeda. Hal ini dikarenakan perbedaan tipe galur
Cronobacter spp. berpengaruh terhadap ketahanan panas
Gambar 8 Hubungan log nilai D dengan suhu untuk isolat lokal dari susu formula.
saling berhimpitan, yang berarti bahwa nilai Z untuk kedua ini sangat berdekatan.
Nilai Z untuk DES b7a dan DES b10 adalah 4.60 C dan 4.62-5.31 C. Nilai Z yang berdekatan antara isolat DES b7a dan DES b10 mungkin disebabkan kedua isolat tersebut berada dalam satu sub klaster yang sama yaitu sub-klaster 2 pada pohon filogenetik (Gitapratiwi 2011).
Gambar 9 Hubungan log nilai D dengan suhu untuk isolat lokal dari makanan bayi.
Gambar 10 menunjukkan hubungan antara log nilai D dan suhu untuk isolat lokal Cronobacter spp. yang berasal dari maizena dan bubuk coklat. Isolat yang diisolasi dari maizena adalah DES c13 sedangkan yang diisolasi dari bubuk coklat yaitu DES d3. Bila dilihat dari bentuk slopenya, isolat DES c13 memiliki kurva yang lebih landai jika dibanding dengan DES d3 yang berarti bahwa nilai Z-nya lebih besar yaitu 5.04-5.69 C sedangkan DES d3 memiliki nilai Z adalah
4.49-4.58 C. Nilai Z yang tinggi pada DES c13 diduga karena DES c13 diisolasi dari maizena yang komposisinya lebih kompleks dibandingkan bubuk coklat.
Penempatan isolat YR t2a, YR c3a, DES b7a, DES b10, dan DES c13 pada sub klaster 2 menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki hubungan kekerabatan, walaupun diisolasi dari berbagai sumber yang berbeda. Bila dilihat dari nilai Z-nya, kelima isolat ini memiliki nilai Z yang berdekatan.
Gambar 10 Hubungan log nilai D dengan suhu untuk isolat lokal dari maizena dan bubuk coklat.
Perbandingan nilai D
Perbandingan nilai D antara galur Cronobacter spp. pada penelitian ini dengan galur-galur yang telah dilaporkan oleh peneliti lain dilakukan pada suhu
52, 54, 56, dan 58 C. Berdasarkan nilai D-nya pada suhu 52 C beberapa isolat lokal Cronobacter spp. memiliki waktu reduksi yang lebih besar jika dibandingkan dengan isolate pustaka. Isolat lokal yang mempunyai waktu reduksi desimal yang besar pada suhu 52 C adalah isolat 6a. Isolat 6a memiliki nilai D52
C paling besar yaitu 87.72-114.94 menit sedangkan isolat lokal yang lain memiliki nilai D yang tidak berbeda dengan isolate pustaka (Gambar 11). Isolat pustaka berdasarkan penelitian Nazarowec-White dan Farber (1997b) menunjukkan koktil galur isolat klinis, galur isolat pangan, dan galur isolat gabungan masing-masing memiliki nilai D52 C 54.76±5.69 menit, 54.82±7.21 menit, dan 54.79±4.71 menit sedangkan Penelitian Kim dan Park (2007) pada Cronobacter spp. isolat NCTC 11467, KWBC 10309, dan KWBC 10102 dengan nilai D52 C 16.43, 19.92, dan 20.08 menit (Gambar 11). Perbedaan nilai D antara tiap isolat dapat disebabkan oleh perbedaan galur isolat dan metode analisis yang digunakan oleh setiap peneliti.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
48 50 52 54 56 58 60
Lo
g
nil
a
i
D
Suhu ( C)
DES c13
Gambar 11 Nilai D52 C berbagai isolat Cronobacter spp. dalam menstruum susu formula, 1) Nazarowec-White dan Farber (1997b) dan 2) Kim dan Park (2007).
Nilai D pada suhu 54 C menunjukkan bahwa nilai D untuk isolat lokal
Cronobacter spp. serupa dengan isolat pustaka. Pada penelitian ini, nilai D lebih besar ditunjukkan oleh isolat YR t2a dibanding dengan isolat lokal yang lain, isolat YR t2a memiliki nilai D31.66-33.67 menit (Gambar 12).
Penelitian Nazarowec-White dan Farber (1997b) pada Cronobacter spp. galur 5 isolat klinis, isolat pangan, dan isolat gabungan dengan nilai D54 C berturut-turut adalah 36.72±6.07, 18.57±1.14, dan 23.70±2.52 menit. Iversen
(2004) dengan isolat NCTC 11467 dan 823 memiliki D54 C 16.4±0.67 menit dan
Gambar 12 Nilai D54 C berbagai isolat Cronobacter spp. dalam menstruum susu formula, 1) Nazarowec-White dan Farber (1997b) dan 2) Iversen (2004).
.
Nilai D pada suhu 56 C isolat lokal Cronobacter spp. serupa dengan isolat pustaka. Isolat lokal yang diuji memiliki nilai D terbesar pada isolat DES c13 (2004) dengan isolat NCTC 11467 dan 823 memiliki D56 C 5.10±0.27 menit dan
D56 C 3.90±0.06 menit. Penelitian Edelson-Mammel dan Buchanan (2004)
sebagai contoh 5 isolat klinis (Nazarowec-White dan Farber (1997b). Akan tetapi (2007), 3) Iversen (2004), 4) Edelson-Mammel dan Buchanan (2004).
Isolat lokal Cronobacter spp. memiliki nilai D 58 C 1.72-3.55 menit meskipun tidak semua isolat yang masuk dalam rentang tersebut karena ada
beberapa isolat yang tidak tahan pada pemanasan suhu 58 C. Penelitian Nazarowec-White dan Farber (1997b) dengan Cronobacter spp. galur klinis, galur pangan, dan galur isolat gabungan memiliki nilai D58 C masing-masing 5.45±0.46, 3.44±0.35, dan 4.20±0.57 menit. Iversen et al. (2004) dengan isolat NCTC 11467 dan 823 memiliki D58 C 2.6±0.48 menit dan D58 C 3.80±1.95 menit. Breeuwer et
al. (2003) dengan isolat 1387-2 dengan nilai D58 C 0.5 menit. Penelitian
Mammel dan Buchanan (2004) dengan Cronobacter spp. ATCC 51329, NQ2-Environ, NQ3-NQ2-Environ, 607, 401C, dan LCDC 648 masing masing dengan nilai
D58 C 0.51±0.00, 0.53±0.03, 0.57±0.07, 9.87±0.83, 9.53±0.39, dan 9.02±0.35 menit. Tiga isolat 607, 401C, dan LCDC 648 mempunyai nilai D yang paling tinggi dibanding isolat yang lain (Gambar 14). Nilai D yang berbeda-beda pada setiap suhu menunjukkan kepekaan relatif dari isolat Cronobacter spp. untuk suhu yang berbeda-beda.
Gambar 14 Nilai D58 C berbagai isolat Cronobacter spp. dalam menstruum susu formula, 1) Nazarowec-White dan Farber (1997b), 2) Iversen (2004), 3) Breeuwer et al. (2003), 4) Edelson-Mammel dan Buchanan (2004).
Perbandingan Nilai Z Beberapa Galur Cronobacter spp.
Perbandingan nilai Z beberapa galur Cronobacter spp. dilakukan berdasarkan asal isolat. Asal isolat diantaranya berasal dari susu formula dan klinis. Asal isolat dari susu formula untuk isolat lokal Cronobacter spp. diantaranya 6a, YR t2a, dan YR c3a. Sementara itu isolat (pustaka) yaitu NCTC 11467 (Kim & Park 2007), 5 isolat pangan (Nazarowec-White & Farrber 1997b)
