HASIL PENELITIAN
5.2 Uji Kepekaan Daya Antibakteri
5.2.1 Metode Dilusi
Uji kepekaan dengan metode dilusi (metode pengenceran ganda) dapat dikerjakan memakai media cair yaitu dengan sederetan tabung reaksi dan media padat yaitu dengan media agar padat.
Pengujian daya antibakteri dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba. Dimulai dari konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% dan 3,125%. Penetapan konsentrasi berdasarkan pada strandart laboratorium Mikrobiologi, USU. Perubahan yang terjadi ditandai dengan hasil biakan mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan control Mc. farland yang diinkubasi 24 jam. Pada gambar 13 menunjukan tabung dengan konsentrasi 100% hingga 3,125% yang direplikasi 4 kali. Dari hasil pengujian tersebut terdapat kekeruhan pada tabung kelompok bahan coba.
a b.
Gambar 12. Uji antibakteri daun Afrika terhadap Streptococcus mutans dengan metode dilusi diinkubasi 24 jam.(a) metode dilusi yang direplikasi 4 kali (b). tidak menunjukan perubahan kekeruhan.
Secara kekeruhan tidak menunjukan perubahan warna karena warna ekstrak pekat. Maka untuk membuktikan bahwa adanya tingkat kekeruhan pada setiap konsentrasi menunjukkan bahan coba memiliki daya hambat bakteri maka dilanjutkan dengan media padat sebagai berikut.
35
Gambar 13. Kontrol positif media MHB+S.mutans menunjukan S.mutan tumbuh dengan baik
Gambar 14. Kontrol negatif media MHB + S.mutans + Formalin menandakan bakteri tidak tumbuh sehingga tampak jernih
12,5% 6,25 3,125%
Gambar 16. Hasil Peletakan
Konsentasi 12,5%, 6,25% dan
3,125% ekstrak daun Afrika yang diinkubasi selama 24 jam.
100% 50% 25%
Gambar 15. Hasil peletakan
Konsentrasi 100%, 50%, dan 25% ekstrak daun Afrika yang diinkubasi selama 24 jam.
36
Pada media padat ini, pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5% tidak dijumpai adanya pertumbuhan bakteri tetapi pada konsentrasi 6,25% dan 3,125% terlihat adanya pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan.
Dari hasil pengujian secara difusi kadar bunuh minimum (KBM) dapat ditentukan dengan bahan coba yang dapat membunuh bakteri 99% mati. Maka dari itu konsentrasi antimikroba terendah dimana tidak ada pembentukan koloni dari bakteri yang di uji yaitu pada konsentrasi 12,5%. Setelah itu dengan melihat kekeruhan pada tabung kadar hambat minimum (KHM) yaitu konsentrasi terendah dimana bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri (50%) setelah diinkubasi 24 jam. Pada tabung tidak dapat menentukan pertumbuhan bakteri dengan melihat kekeruhan campuran dalam tabung. Selanjutnya dipastikan dengan melakukan subkultur dari tabung untuk media padat dan dilihat pada konsentrasi 6,25% masih terdapat pertumbuhann bakteri yang tidak semua mati.
Dengan konsentrasi 6,25% bakteri yang belum mati semua pada konsentrasi tersebut dilanjutkan dengan metode serial dilusi yaitu pengenceran bertahap secara konstan sehingga jumlah koloni bakteri dapat dihitung. Dengan cara pengerjaan dengan menyediakan 4 tabung berisi 0,9 NaCl, lalu pada tabung pertama di tambahkan 1 µl suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet. Pada tabung kedua 1 µl dari tabung pertama dan tambahkan pada tabung kedua, lalukan berulang hingga tabung keempat. Setelah itu, masing masing tabung divorteks dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37º lalu tabung diteteskan pada media agar dan di diamkan selama 15-20 menit sampai kering dan di inkubasi lagi selama 24 jam pada suhu 37º. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri. Berdasarkan hasil perhitungan koloni seperti pada (gambar 17) dapat dilihat bahwa jumlah koloni dapat dihitung pada serial dilusi atau pengenceran yang ke empat yaitu dengan faktor dilusi 106.
37
103 104
105 106
Gambar 17. Hasil Perhitungan koloni bakteri serial dilusi pada konsentrasi 6,25%
Tabel 3. Hasil Metode Dilusi Uji Efektivitas Antibakteri Ekstrak Daun Afrika (Vernonia amygdalina) dalam Pelarut Etanol 70% terhadap Streptococcus mutans
Konsentrasi Bahan uji Ekstrak daun
Afrika(Vernonia amygdalina) REPLIKASI (CFU/ml) Rata-Rata (CFU/ml) I II III IV 100% 0 0 0 0 0 50% 0 0 0 0 0 25% 0 0 0 0 0 12,50% 0 0 0 0 0 6,25% 10,8.106 10,2.106 10,6.106 10,4.106 10,5.106 Kontrol mc. Farland (CFU/ml) 50,8.106 50,4.106 50,3.106 50,6.106 50,5.1010 Kontrol negative 0 0 0 0 0 (Bahan Uji)(CFU/ml)
Keterangan : 0 = streril, tidak ada pertumbuhan bakteri ; TBUD = Tidak Bisa Untuk Dihitung, CFU/ml= Colony Forming Unit per milliliter (sudah dikali dengan 20 faktor pengali)
38
Tabel 3 menunjukkan hasil efek antibakteri ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% dan 3,125% terhadap pertumbuhan Streptococcus mutans. Pada Konsentrasi 100% dan 50%, 25%, 12,5% yang mampu membunuh bakteri yang tumbuh sebanyak 0 CFU/ml dan menunjukan hasil yang sama pada setiap replikasi yang berarti bahwa setelah penanaman pada media dan diinkubasi selama 24 jam tidak terlihat adanya pertumbuhan bakteri atau semua bakteri mati. Pada konsentrasi 6,25% ditemukan pertumbuhan koloni bakteri dengan jumlah yang bervariasi pada setiap replikasi dengan nilai rata-rata 10,5.106 CFU/ml sementara pada konsentrasi 3,125% juga dijumpai pertumbuhan bakteri yang masih subur dan tumpang tindih sehingga hasil dikatagorikan TBUD (Tidak Bisa Untuk Dihitung).
Hasil data pengamatan uji dilusi kemudian di analisi dengan Uji Kruskal-Wallis dan uji Man-Whitney.
Tabel 4. Uji Kruskal-Wallis Konsentrasi Ekstrak Daun Afrika (Vernonia amygdalina) Secara Dilusi
Konsentrasi Median±Inerquartil Range Hasil Uji Statistik
100% 0 0,000 50% 0 25% 0 12,5% 0 6,25% 1 - 50000 Kontrol+ 5 - 425000
Tabel 4 menunjukkan tabel uji Kruskal-Wallis yang menunjukkan rata-rata dari masing-masing konsentrasi ekstrak daun Afrika (Vernonia amygdalina) beserta standar deviasi dan signifikansinya dengan menggunakan uji statistik Kruskal-Wallis. Median menunjukkan nilai tengah dari masing-masing konsentrasi. Interquartil range menunjukkan nilai dari batas atas dan batas bawah sedangkan Hasil Uji Statistik menunjukkan nilai p yang menyatakan bahwa terdapat perbedaan pada data-data yang diujikan. Pada Tabel 4 diperoleh nilai p sebesar 0,000 dimana nilai p < 0,05 sehingga
39
dapat ditarik kesimpulan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan dari data yang diuji antara masing-masing konsentrasi ekstrakdaun Afrika (Vernonia amygdalina).
Tabel5. Uji Mann-Whitney Konsentrasi Ekstrak Daun Afrika (Vernonia amygdalina) Secara Dilusi 100% 50% 25% 12,5% 6,25% Kontrol+ 100% 1 1 1 0,014 0,014 50% 1 1 1 1 25% 1 1 1 12,5% 1 1 6,25% 0,021 Kontrol +
Nilai p perbedaan mean pada 0,05
Tabel 5 merupakan tabel uji Mann-Whitney yang menunjukkan nilai signifikansi hubungan antara masing-masing konsentrasi mulai dari konsentrasi 100% hingga 6,25% daun Afrika (Vernonia amygdalina) dengan perbedaan signifikansi pada angka 0,05. Apabila nilai p lebih kecil dari 0,05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan signifikan antara data yang dibandingkan sedangkan apabila nilai p lebih besar dari 0,05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang tidak signifikan dan tidak terdapat perbedaan. Pada tabel 6 terlihat bahwa p data yang lebih kecil dari 0,05 terdapat pada hubungan data konsentrasi 6,25% dan kontrol + dengan 100% dan 6,25% dengan kontrol +.