Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama delapan minggu di Laboratorium Fisiologi Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan- IPB dan Kennel Subdit Satwa POLRI-Depok. Pengambilan sampel darah dilakukan sebanyak dua kali yaitu pada tanggal 8 Februari 2006 (H-1) dan pada tanggal 20 Februari 2006 (H-2) di Kennel Subdit Satwa POLRI-Depok dengan didampingi oleh dokter hewan setempat dan pawang dari anjing pelacak ras Labrador Retriever yang akan diambil sampel darahnya.
Bahan dan Alat
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah anjing pelacak operasional ras Labrador Retriever di Subdit Satwa POLRI sebanyak tujuh ekor (lima ekor jantan-dua ekor betina yang berumur lebih dari tiga tahun dan merupakan anjing impor yang sudah didomestikasi) tanpa diberikan perlakuan apapun dan sebelum melakukan aktivitas rutin pelatihan anjing pelacak.
Bahan-bahan hematologi yang digunakan dalam penelitian ini adalah: larutan fisiologis NaCl 0.9%,alkohol 70%, heparin, creatoseal, larutan HCl 0.1N, larutan pengencer Hayem, larutan pengencer Turk, aquabidest dan pewarna Giemsa.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spoit, kapas, venoject, tabung reaksi, gelas objek dan cover glass (kaca penutup), mikroskop, pipet eritrosit dan aspirator, pipet leukosit, kamar hitung hemositometer, mikro hematokrit, alat baca hematokrit (Hematocrite reader), kertas atau kain yang lembut, tabung sahli, hemoglobinometer, wadah pewarnaan giemsa, dan termos es.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan darah pada anjing dapat diambil melalui vena cephalica antibrachii lateralis sebanyak + 2 ml setelah dilakukan pemeriksaan klinis terhadap anjing tersebut terlebih dahulu. Darah yang keluar dari vena terlebih dahulu diteteskan ke atas gelas objek untuk membuat preparat ulas darah untuk dilakukan pengamatan diferensiasi leukosit, setelah itu darah yang ada dalam spoit segera dimasukkan ke dalam tabung venoject yang telah berisi antikoagulan (heparin) untuk dilakukan pemeriksaan aspek hematologis lainnya (jumlah eritrosit, jumlah total leukosit, nilai hematokrit, dan kadar hemoglobin). Sampel darah yang telah diperoleh kemudian dibawa ke Laboratorium Fisiologi FKH IPB dengan menggunakan termos es untuk selanjutnya diamati.
Gambar 12. Pengambilan darah di vena cephalica antibrachii
(Anonimd 2007).
Penghitungan Jumlah Eritrosit
Darah yang digunakan dalam penghitungan jumlah eritrosit adalah darah yang telah diberi antikoagulan heparin. Sampel darah dihisap menggunakan pipet eritrosit hingga tanda tera 0,5 dengan aspirator. Ujung pipet dibersihkan dengan menggunakan tissu, lalu pengencer hayem dihisap hingga tanda 101. Dua karakteristik penting dari larutan pengencer RBC/eritrosit adalah larutan bersifat isotonik dengan sel darah merah; jika tidak keseimbangan osmotik eritrosit akan terganggu dan bentuk dari eritrosit menjadi abnormal dan pada kasus yang parah adalah eritrosit hancur/lisis. Larutan pengencer haruslah dapat melindungi eritrosit agar tidak menyusut dan tersuspensi secara sempurna. Larutan pengencer Hayem memenuhi karakteristik-karakteristik tersebut (Haen 1995). Pipet digerakkan
memutar dengan membentuk angka delapan selama tiga menit. Setelah homogen, cairan yang tidak terkocok pada ujung pipet dibuang dengan menempelkan ujung pipet ke kertas tissu. Setelah itu teteskan satu tetes ke dalam hemositometer, usahakan jangan sampai ada udara yang masuk. Setelah itu dibiarkan selama beberapa saat sehingga cairan mengendap, lalu penghitungan dapat dimulai. Agar tidak terjadi penghitungan dobel maka sebaiknya menggunakan hand counter di bawah mikroskop dengan pembesaran 45x10. Untuk menghitung eritrosit dalam hemositometer, digunakan kotak eritrosit yang berjumlah 25 buah dengan mengambil bagian sebagai berikut: satu kotak pojok kanan atas, satu kotak pojok kiri atas, satu kotak ditengah, satu kotak pojok kanan bawah dan satu kotak pojok kiri bawah. Untuk membedakan kotak eritrosit dengan kotak leukosit dapat berpatokan pada tiga garis pemisah pada kotak eritrosit serta luas kotak eritrosit yang relatif lebih kecil dibandingkan dengan kotak leukosit. Setelah jumlah butir eritrosit didapatkan maka jumlahnya dikalikan dengan 104 untuk mengetahui jumlah eritrosit dalam 1 mm3 darah (Anonim 2001).
Keterangan :
a) Jumlah eritrosit hasil penghitungan dalam hemositometer Penghitungan Jumlah Leukosit
Sampel darah dihisap dengan menggunakan pipet leukosit hingga tanda tera 0,5 dengan aspirator. Ujung pipet dibersihkan dengan menggunakan tissu, lalu larutan pengencer Turk dihisap sampai tanda 11. Kemudian pipet diputar dengan membentuk angka 8 selama 3 menit, setelah homogen cairan yang tidak terkocok pada ujung pipet dibuang dengan menempelkan ujung pipet pada kertas tissu. Setelah itu teteskan satu tetes ke dalam hemositometer, diusahakan jangan sampai ada udara yang masuk, dibiarkan selama beberapa saat hingga cairan mengendap lalu penghitungan dapat dimulai. Agar tidak terjadi penghitungan yang dobel maka sebaiknya menggunakan alat bantu hand counter di bawah mikroskop dengan pembesaran 45x10.
Jumlah Total Eritrosit = a x 104 mm3
Untuk menghitung leukosit dalam hemositometer, digunakan kotak leukosit. Jumlah leukosit yang didapat dari hasil perhitungan dikalikan 50 untuk mengetahui jumlah leukosit setiap 1 mm3 darah (Anonim 2001).
Jumlah Total Leukosit = b x 50 mm3 Keterangan:
b) Jumlah leukosit hasil penghitungan dalam hemositometer Penghitungan Diferensiasi Leukosit
Darah yang telah disiapkan diteteskan ke atas gelas objek, kemudian ditempelkan ujung gelas objek yang lain dengan membentuk sudut kurang lebih 450, kemudian gelas objek didorong dengan kecepatan konstan sehingga didapatkan ulasan yang cukup tipis. Setelah itu, ulasan yang didapat dikeringkan di udara selama beberapa menit. Lalu dilakukan fiksasi ulasan dalam methanol selama 5-10 menit. Ulasan kemudian dicelupkan ke dalam pewarna giemsa 10% selama kurang lebih 30 menit. Setelah 30 menit ulasan diangkat dan dicuci menggunakan air yang mengalir sampai air bilasan tidak membawa warna giemsa. Kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissu. Penghitungan dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x10 menggunakan minyak emersi. Diferensiasi leukosit dihitung dari satu lapang pandang ke lapang pandang yang lain hingga diperoleh sejumlah 100 sel leukosit. Untuk menghindari kesalahan dalam menghitung dapat digunakan alat bantu hand counter (Anonim 2001). Setelah diketahui persentase masing-masing jenis leukosit, maka dihitung nilai absolutnya dengan cara dikali dengan jumlah total leukosit untuk mendapatkan jumlah absolut masing-masing jenis leukosit tersebut.
Penghitungan Nilai Hematokrit
Pengisian pipa mikrokapiler hematokrit dilakukan dengan memiringkan tabung yang berisi sampel darah dengan menempatkan ujung mikrokapiler yang bertanda merah. Pipa diisi sampai mencapai 2/3 bagian kemudian ujung pipa disumbat dengan creatoseal, kemudian pipa mikrokapiler tersebut ditempatkan dalam alat pemusing (mikrosentrifuse) dan bagian yang tersumbat ditempatkan menjauhi mikrosentrifuse kemudian disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan putaran 2500 rpm.
Gambar 13. Alat sentrifuse (kiri), mikrokapiler hematokrit (kanan) (Anonime 2007).
Setelah selesai disentrifuse, terbentuk lapisan-lapisan terdiri atas plasma jernih di bagian atas, kemudian lapisan putih abu-abu (trombosit dan leukosit) disebut buffy coat, dan lapisan merah yang terdiri atas eritrosit. Nilai hematokrit atau yang disebut juga dengan Packed Cell Volume (PCV) dapat dibaca menggunakan hematokrit reader.
Gambar 14. Mikrohematokrit reader. (Anonimf 2007).
Penghitungan Kadar Hemoglobin.
Metode yang digunakan untuk menentukan kadar hemoglobin adalah metode Sahli. Larutan HCL 0.1 N diteteskan pada tabung sahli sampai tanda tera 10 atau garis bawah. Kemudian sampel darah dihisap menggunakan pipet sahli sehingga mencapai tanda tera atas (2.0 cmm). Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung dan ditunggu selama 3 menit atau hingga berubah warna menjadi coklat kehitaman akibat reaksi antara HCl dengan hemoglobin membentuk asam hematin. Setelah itu larutan ditambah dengan aquadest, teteskan sedikit demi sedikit sambil diaduk. Larutan aquadest ditambahkan hingga warna larutan sama dengan warna pada standar hemoglobinometer. Nilai hemoglobin dilihat di kolom gram% yang tertera pada tabung hemoglobin (Anonim 2001).
Menghitung MCV, MCH dan MCHC
MCV menunjukkan volume atau ukuran rata-rata eritrosit dalam femtoliter (fL), fL = 10-15/L. Dihitung dengan membagi volume eritrosit per liter oleh jumlah butir eritrosit per liter, menggunakan rumus:
MCV dalam μm3 atau fl (femtoliter)
= PCV X 10
Jumlah eritrosit per μl darah X (10-6)
dimana faktor 10 adalah untuk mengkonversi pembacaan hematokrit (dalam %) dari volume PCV per desiliter ke volume per liter (= 1,000 mL).
MCH didasarkan pada perkiraan kuantitas/berat hemoglobin dalam rata- rata eritrosit. MCH dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
MCH dalam μμg atau pg (pikoliter)
= hemoglobin dalam g/dl X 10 Jumlah eritrosit per μl darah X (10-6)
Sedangkan MCHC menunjukkan rata-rata konsenterasi hemoglobin per unit volume PCV, dengan satuan gram per desiliter. Dapat dihitung dari hemoglobin dan nilai hematokrit dengan menggunakan rumus berikut:
MCHC dalam g/dl atau g % = hemoglobin dalam g/dl X 100
PCV dalam ml/dl (Swenson 1984).