Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan sejak bulan Juli 2007 hingga bulan Mei 2008, bertempat di kandang B (kandang ayam) Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor dan Bagian Patologi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Ransum ayam yang terdiri dari kombinasi pakan basal, bawang putih, kunyit dan ZnO. Saat pemeliharaan ayam dibutuhkan air, vaksin ND, vaksin gumboro dan sekam, sedangkan untuk pemeriksaan histopatologi digunakan larutan Buffer Neutral Formalin (BNF) 10%, xylol, alkohol absolut (100%), alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70%, Mayer’s hematoxilin, lithium carbonat, eosin, perekat etelan, parafin cair dan aquades.
Peralatan yang digunakan yaitu: kandang ayam, timbangan, tempat pakan dan minum, pisau bedah, gunting bedah, cover glass, object glass, mikrotom, inkubator dengan suhu 53.6oC, pemanas air, lemari pendingin, mikroskop, kertas label, kaset jaringan dan tissue processor.
Metode Penelitian Perlakuan Hewan Coba
Penelitian menggunakan 100 ekor ayam broiler strain Ross 1 Super Jumbo 747 diproduksi oleh PT. Cibadak Nusa Indah Sukabumi berumur satu hari. Sebanyak 100 ekor DOC (Day Old Chick) dibagi secara acak ke dalam lima perlakuan. Masing-masing perlakuan terdiri dari empat ulangan, sehingga ada 20 unit percobaan dan masing-masing unit percobaan terdiri dari 5 ekor DOC yang dipelihara dalam kandang ukuran 1x1x1 m3 beralas sekam dan telah ditimbang untuk mengetahui bobot badan awal.
Pemeliharaan dilakukan sampai ayam berumur 5 minggu. Saat ayam berumur 4 hari diberikan vaksin ND I melalui tetes mata, vaksin gumboro
19
diberikan saat ayam berumur 10 hari melalui air minum dan vaksin ND II diberikan saat ayam berumur 21 hari melalui mulut (cekok). Selama pemeliharaan ternak ayam terinfeksi virus Marek secara alami serta pakan dan minum diberikan secara ad libitum
Pembuatan Serbuk Bawang Putih dan Kunyit
Proses pembuatan serbuk bawang putih maupun kunyit diperoleh melalui serangkaian proses, mula-mula dilakukan pencucian kunyit segar hingga bersih dari tanah yang melengket dan ditiriskan kemudian diiris-iris tipis, sedangkan bawang putih dilakukan pengelupasan kulit luar lalu diiris tipis-tipis. Irisan kunyit dan bawang putih yang sebelumnya telah dilapisi dan ditutup plastik hitam tipis kemudian dijemur di bawah sinar matahari hingga kering, lalu digiling untuk dibuat serbuk. Selanjutnya dilakukan pengayakan, untuk memisahkan bahan padatan dan hanya yang berukuran kecil yang akan lolos.
Pakan
Pakan yang telah disusun dicampur dengan serbuk kunyit, serbuk bawang putih, dan penambahan mineral zink dalam bentuk ZnO, kemudian ransum perlakuan diberikan pada ayam broiler yang masih berumur satu hari (DOC) setelah pengacakan sampai berumur 5 minggu. Kombinasi pakan perlakuan terdiri dari:
R0 = Pakan basal (kontrol)
R1 = Pakan basal ditambah bawang putih 2.5% dan kunyit 1.5% R2 = Pakan basal ditambah bawang putih 2.5% dan ZnO 120 ppm R3 = Pakan basal ditambah kunyit 1.5% dan ZnO 120 ppm
R4 = Pakan basal ditambah bawang putih 2.5% dan kunyit 1.5% dan ZnO 120 ppm
20
Tabel 2 . Komposisi Pakan Penelitian
Bahan R0 R1 R2 R3 R4 Jagung (%) Dedak (%) Minyak (%) Tepung ikan (%) Bungkil kedelai (%) CaCO3 (%) DCP (%) Premiks (%)* Lysin (%) 51 3 5.5 12 26.3 1 0.5 0.5 0.1 Methionin (%)
* Setiap 1 kg premiks mengandung: vitamin A = 4.000.000 IU, D3 = 800.000 IU, E = 4.500 mg, K3 = 450 mg. B 0.1 51 3 5.5 12 26.3 1 0.5 0.5 0.1 0.1 51 3 5.5 12 26.3 1 0.5 0.5 0.1 0.1 51 3 5.5 12 26.3 1 0.5 0.5 0.1 0.1 51 3 5.5 12 26.3 1 0.5 0.5 0.1 0.1 Total (%) 100 100 100 100 100 Kunyit (%) 0 1.5 0 1.5 1.5 Bawang putih (%) 0 2.5 2.5 0 2.5 ZnO (%) 0 0 0.012 0.012 0.012 B 1 = 450 mg, B2 = 1.350 mg, B6 = 480 mg, B12 = 6 mg, Ca-d pantothenate = 2.400 mg, Folic acid = 270 mg, Nicotinic acid = 7.200 mg, Choline chloride = 28.000 mg, DL- methionine = 28.000 mg, L-Lysine = 50.000 mg, Fe = 8.500 mg, Cu = 700 mg, Mn = 18.500 mg, Zn = 14.000 mg, Co = 50 mg, I = 70 mg, Se = 35 mg, Antiox, carrier add = 1kg
Pengambilan Sampel dan Pembuatan Preparat Histopatologi
Pengambilan sampel ginjal melalui nekropsi ayam dari setiap unit coba, kemudian organ difiksasi dalam larutan Buffer Neutral Formnalin (BNF) 10% selama 3x24 jam yang selanjutnya dibuat sediaan histopatologi.
Pembuatan sediaaan histopatologi diawali memotong sampel organ setebal ± 1 cm dan dimasukkan ke dalam kaset jaringan untuk dilakukan proses dehidrasi dalam larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat, yaitu alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, alkohol absolut I dan II. Selanjutnya proses penjernihan (clearing) dengan cara memasukkan sediaan ke dalam xylol I dan II dan di-embedding
dalam parafin cair, embedding sebaiknya dilakukan dekat sumber air panas dan alat-alat dihangatkan terlebih dahulu untuk mencegah pembekuan parafin. Parafin yang digunakan adalah parafin histoplast yang memiliki titik didih 56-67oC.
21
Jaringan yang sudah diblok dengan parafin kemudian dipotong menggunakan mikrotom yang terlebih dahulu disimpan dalam lemari es agar parafin lebih keras dan lebih mudah dipotong. Jaringan dipotong dengan ketebalan 3-5 mikron, sayatan lalu diapungkan di atas air hangat dengan suhu ± 60oC. Sayatan tersebut diangkat dengan menggunakan gelas objek yang sebelumnya telah dibersihkan, kemudian dikeringkan dalam inkubator bersuhu 53.6oC selama 24 jam. Proses selanjutnya adalah pewarnaan jaringan dengan menggunakan pewarna hematoksilin dan eosin (HE).
Ada 5 tahap yang dilakukan dalam pewarnaan HE:
1. Deparafinasi, yaitu menghilangkan parafin dari jaringan dengan dimasukkan ke dalam xylol I dan II.
2. Rehidrasi, yaitu memasukkan sediaan ke dalam larutan alkohol konsentrasi menurun yaitu dimulai dari alkohol III, II, I, alkohol 100%, 95%, 90%, 80% dan 70%.
3. Pewarnaan HE.
4. Clearing atau penjernihan dengan xylol I, II, III.
5. Mounting atau penutupan sediaan dengan cover glass.
Cara melakukan pewaranaan HE adalah melakukan perendaman preparat dengan larutan sebagai berikut:
- Xylol I selama 2 menit - Xylol II selama 2 menit
- Alkohol absolut selama 2 menit - Alkohol 95% selama 1 menit - Alkohol 80% selama 1 menit
- Cuci dengan air kran selama 1 menit - Mayer’s haematoxylin selama 8 menit - Cuci dengan air kran selama 30 detik - Lithium carbonat selama 15-30 detik - Cuci dengan air kran selama 2 menit - Eosin 2-3 menit
- Cuci dengan air kran selama 30-60 detik - Alkohol 95% sebanyak 10 celupan
22
- Alkohol absolut I sebanyak 10 celupan - Alkohol absolut II selama 2 menit - Xylol I selama 1 menit
- Xylol II selama 2 menit
- Tutup dengan cover glass menggunakan perekat etelan (1 tetes)
Gelembung udara pada preparat dihilangkan dengan cara melakukan penekanan agar gelembung udara terdorong kepinggir dan keluar dari preparat sewaktu dilakukan perekatan dengan cover glass agar tidak menghalangi waktu pengamatan.
Pengamatan Histopatologi
Evaluasi histopatologi dilakukan dengan menghitung rata-rata pertumbuhan sel tumor limfoid pada 3 fokus tumor Marek, presentase kejadian degenerasi dan nekrosa dari 25 tubulus dan presentase kejadian kongesti dari 25 glomerulus dengan menggunakan perbesaran objektif 40x.
Analisis Data
Analisis data hasil perhitungan terhadap pertumbuhan sel tumor, lesio pada tubulus dan glomerulus ginjal dilakukan dengan uji Anova untuk melihat pengaruh perlakuan. Jika perlakuan berpengaruh nyata, dilanjutkan dengan uji Duncan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan.
23