Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Waktu kegiatan dimulai dari bulan April 2006 hingga Agustus 2006 yang dilanjutkan dengan pengamatan preparat dan pengolahan data pada bulan Februari hingga Mei 2007.
Materi • Hewan
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus) sebanyak 45 ekor.
• Minyak obat luka Rantau
Minyak obat luka Rantau diperoleh langsung dari daerah Rantau, Kabupaten Tapin, Kalimantan Selatan yang telah diolah dan dikemas baik.
• Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pakan dan minum mencit, BNF (Buffer Neutral Formalin) 10%, eter, NaCl fisiologis, alkohol 70%, akuades, obat cacing dengan zat aktif imidazol, antibiotik (cephalosphorin yang diberikan sehari pasca laparotomi dan penisilin-streptomisin diberikan setelah penjahitan laparotomi dilakukan), serta obat bius (ketamin dan xylazin).
• Peralatan
Peralatan penelitian yang digunakan adalah: kandang adaptasi dan kandang percobaan mencit, timbangan digital, anaerobic jar, kertas buram, sonde lambung, spoit 1 ml, pipet mikrometer, botol minum mencit, silet, jarum jahit, cat gut, talenan, stiroform, aluminium foil, 1 set jarum pentul, alat bedah dan nekropsi (pinset, scalpel, gunting), kertas label, kapas, tissue, plastik tempat sampel, cawan petri, gelas objek, gelas penutup (cover glass), mikroskop, video micrometer dan video foto mikroskop.
19
Metode • Kandang
Kandang yang digunakan ada dua macam yaitu kandang adaptasi dan kandang percobaan. Kandang adaptasi dan kandang percobaan berupa kotak plastik dengan ukuran 20 x 30 cm sebanyak 15 buah dan tutup dari kawat untuk sirkulasi udara.
• Perlakuan terhadap Mencit Percobaan
Mencit yang digunakan berjumlah 45 ekor yang dibagi menjadi 3 kelompok perlakuan yaitu kontrol positif yang diberi antibiotik (cephalosphorin) pasca laparotomi flank, kontrol negatif tanpa pemberian obat dan kelompok perlakuan yang diberi minyak obat luka pasca laparotomi flank. Tiap perlakuan dibagi lagi menjadi 5 kelompok kecil (masing-masing dengan 3 ekor ulangan) berdasarkan waktu pengambilan sampel yaitu pada hari kedua, keempat, keenam, ketiga belas dan kedua puluh pasca pengobatan (pp).
Masa adaptasi mencit dipelihara pada kandang-kandang yang telah disediakan dengan diberi makan, minum, obat cacing dan antibotik (cephalosphorin) peroral. Pemberian obat cacing hanya sekali saja sedangkan untuk antibiotik diberikan selama 5 hari berturut-turut. Setelah pemberian obat cacing dan antibiotik, mencit dibiarkan selama 7 hari tanpa perlakuan dan selanjutnya dilakukan laparotomi (Gambar 10).
14 hr
L O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 0
Gambar 10 Skema Metodelogi Penelitian. Hari Pengamatan Laparotomi Flank Pemberian Obat
Pengambilan Sampel Pengambilan Sampel Pengambilan Sampel Adaptasi
20
• Operasi dan Pemberian Obat Luka
Sebelum dilakukan laparotomi flank, mencit dengan bobot badan rata-rata 30 gram diberi anastesi menggunakan kombinasi Ketamin (10%) dan Xylazin (20%) secara Intra Peritonial (IP). Selanjutnya rambut di sekitar lokasi sayatan dicukur dengan menggunakan gunting/silet lalu kulit diseka dengan kapas beralkohol 70%. Mencit disayat menggunakan scalpel pada bagian abdomen daerah flank secara aseptis sepanjang 1-1,5 cm. Arah sayatan vertikal searah os. Costae pada sisi kiri abdomen. Lapisan pada abdomen disayat mulai dari lapisan terluar daerah abdomen yaitu lapisan kulit (epidermis dan dermis),
m. rectus abdominis hingga lapisan peritonium lalu diberi antibiotik penisilin-streptomisin dan luka sayatan ditutup kembali dengan melakukan penjahitan secara aseptis.
Sehari setelah pembedahan (laparotomi flank), mencit diberi antibiotik (Cephalosphorin) untuk kelompok kontrol positif dan minyak obat luka Rantau untuk kelompok perlakuan dengan pemberian minyak obat luka sedangkan untuk kelompok kontrol negatif tanpa pemberian obat. Antibiotik dan minyak obat luka diberikan peroral dengan menggunakan stomach tube dengan dosis antibiotik 250/kg BB dan minyak obat luka 1 ml/50 kg BB.
• Pengambilan dan Pembuatan Preparat Darah
Darah diambil langsung dari organ jantung segera setelah penyayatan daerah thoraks dilakukan dengan menggunakan spoit lalu dibuat preparat ulas darah.
Darah dari spoit diteteskan secukupnya ke atas sebuah objek glass, selanjutnya dengan menggunakan salah satu sisi dari glass objek yang lain dilakukan ulas darah (kemiringan ± 60O) dan dibiarkan hingga kering. Preparat ulas dimasukkan kedalam larutan methanol selama ± 5 menit lalu dimasukkan ke dalam larutan pewarna giemsa selama ± 25 menit.
• Pengambilan Sediaan dan Pembuatan Preparat Histopatologi Organ Timus, Limfonodus dan Limpa dengan Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE).
Setelah dilakukan pengamatan patologi anatomi dan diambil darahnya, mencit percobaan dieuthanasi dengan menggunakan kloroform yang diteteskan pada kapas dalam anaerobic jar. Mencit percobaan kemudian disayat pada
21
bagian ventral tubuh, yakni dari daerah thoraks hingga ke posterior abdomen dan diambil organ timus, limfonodus dan limpa. Organ yang telah diambil selanjutnya dimasukkan ke dalam botol berisi larutan Buffer Netral Formalin (BNF) 10%, fiksasi selama ± 48 jam.
Organ yang telah difiksasi selanjutnya diproses di Laboratorium Patologi dengan langkah-langkah sebagai berikut:
- Penipisan (trimming)
Organ diiris tipis ± 0,5 cm. Daerah yang diambil adalah bagian tengah organ, lalu dimasukkan ke dalam kaset.
- Proses dehidrasi
Potongan organ yang telah ditipiskan (triming) kemudian dimasukkan ke dalam automatic tissue berturut-turut dengan menggunakan larutan alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 95% I dan alkohol 95% II, alkohol 100% I dan alkohol 100% II, masing-masing selama ± 2 jam. - Proses penjernihan (clearing) dan imersi dalam larutan parafin
Sediaan kemudian direndam dalam alkohol 100% dan xylol dengan perbandingan 1:1 selama 45 menit, kemudian direndam dalam xylol dua kali masing-masing selama 45 menit. Selanjutnya dimasukkan ke dalam xylol parafin pada gelas pemanas dengan suhu 60 OC dua kali masing-masing selama 45 menit.
- Pencetakan (embeding)
Sediaan dimasukkan ke dalam alat pencetak berisi parafin cair. Lalu diatur letak sediaan dengan arah vertikal dan horizontal. Pada saat parafin mulai membeku, parafin ditambahkan kembali sampai alat pencetak penuh dan dibiarkan sampai mengeras.
- Pengirisan dengan mikrotom
Sediaan diiris menggunakan mikrotom dengan tebal 5µm. hasil irisan yang berbentuk pita (ribbon) diletakkan diatas permukaan air dengan suhu ± 45
O
C. sediaan diangkat dari permukaan air menggunakan objek glass dan diletakkan di atasnya. Selanjutnya dimasukkan ke dalam inkubator (60 OC) selama 12 jam.
22 - Pewarnaan
Sediaan dimasukkan ke dalam xylol dua kali masing-masing selama 3 menit. Kemudian didehidrasi berturut-turut ke dalam alkohol 100% selama beberapa menit, dilanjutkan dengan alkohol 95%, alkohol 80% dan alkohol 70% masing-masing selama 1 menit. Sediaan dicuci dengan air dan direndam selama beberapa menit. Sediaan diwarnai dengan pewarnaan umum Hemotoksilin Eosin (HE).
Berikut tahapan pewarnaan HE terhadap sediaan yang berada pada gelas objek:
Proses deparafinisasi dan rehidrasi
Sediaan direndam dalam xylol I selama 2 menit kemudian berturut-turut dilakukan perendaman dalam xylol II selama 2 menit, alkohol absolut selama 2 menit, alkohol 95% selama 1 menit, alkohol 85% selama 1 menit dan dibilas air mengalir selama 1 menit.
Tahap pewarnaan
Sediaan direndam dalam Mayer’s haematoxylin selama 8 menit kemudian dibilas air mengalir selama 30 detik, direndam dalam lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan air mengalir selama 2 menit, Direndam dalam eosin selama 2-3 menit dan dibilas dengan air mengalir 30-60 detik.
Tahap dehidrasi
Setelah proses deparafinisasi, rehidrasi dan pewarnaan selesai dilakukan, sediaan kemudian dicelup dalam alkohol 95% 10 celupan, dicelup dalam alkohol absolut I 10 celupan, dicelup dalam alkohol absolut II selama 2 menit, direndam dalam xylol I selama 1 menit, direndam dalam xylol II selama 2 menit dan direndam dalam xylol II selama 2 menit.
- Penutupan sediaan
Diatas objek gelas ditetesi zat perekat canada balsam dan selanjutnya ditutup dengan gelas penutup sediaan (cover glass). Sediaan kemudian diberi label dan disimpan beberapa jam sampai zat perekatnya kering.
23
• Pengamatan Histopatologi
Pengamatan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop, video fotomikroskop dan video micrometer. Adapun parameter pengamatan adalah diferensiasi darah untuk preparat ulas darah pada 10 lapang pandang (1 lapang pandang = 201,5 µm persegi), mengukur ketebalan korteks dan medula organ timus, menghitung jumlah folikel dan germinal center serta mengukur diameter folikel atau pulpa putih untuk organ limfonodus dan limpa.
• Analisis Data
Analisis data hasil pengamatan histopatologi dilakukan secara kualitatif (deskriptif) dengan membandingkan data dari ketiga kelompok perlakuan yang dilanjutkan dengan olah data secara statistika (kuantitatif) yaitu dengan uji sidik ragam (ANOVA) dan uji wilayah berganda Duncan.