METODE PENELITIAN
III.2 Metode Kerja .1 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dibersihkan lebih dahulu. Alat yang terbuat dari kaca dibersihkan dengan menggunakan sabun. Cawan petri dan alat-alat lainnya yang tidak berskala dibungkus dengan kertas dan disterilkan dalam oven pada suhu 180˚C selama 2 jam. Alat-alat yang berskala dan tidak tahan terhadap pemanasan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121˚C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit, sedangkan jarum inokulasi disterilkan dengan cara dipijarkan langsung pada nyala api bunsen.
III.2.2 Pembuatan Asam Tartrat 10%
Asam tartrat ditimbang sebanyak 3 gram lalu dilarutkan dengan menambahkan 30 ml aquadest di dalam labu Erlenmeyer, kocok hingga larut. Medium disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit.
III.2.3 Pembuatan Medium Potato Dekstrose Agar (PDA)
Medium PDA ditimbang sebanyak 7,8 gram lalu dilarutkan dalam 200 ml air suling dan dipanaskan. Medium yang telah jadi disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit.
30
III.2.4 Penyiapan Sampel Isolasi
Sampel penelitian yang digunakan berupa daun talas (Xanthosoma sagittifolium [L] Schott.) diperoleh dari Kelurahan Berua, Kecamatan
Biringkanaya, Kota Makassar, Provinsi Sulawesi Selatan.
Daun talas dibersihkan dengan air mengalir dan dikeringkan, lalu dipotong dengan ukuran ±2 cm2, kemudian sampel disterilisasi permukaan dengan dicelupkan ke dalam labu Erlenmeyer yang berisi etanol 70%
(kocok pelan selama 1 menit), lalu dikeluarkan dan dicelupkan kembali ke dalam natrium hipoklorit (Bayclin®) 5,25% selama 30 menit dengan perlakuan yang sama, kemudian dibilas dengan air suling steril sebanyak 3 kali. Sampel ditiriskan diatas kertas saring steril, kemudian dipotong dengan ukuran ± 1 cm2.
III.2.5 Isolasi Fungi Endofit
Medium PDA yang telah dibuat dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak ±20 ml, pH diatur <4 dengan menambahkan asam tartrat 10%
sebanyak 0,2 ml, lalu ditunggu hingga memadat. sampel yang telah dipotong diletakkan di atas medium dan diinkubasi pada suhu 25˚C selama 7x24 jam. Semua proses dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF). Sebagai kontrol, diinokulasikan air cucian eksplan
terakhir, sampel yang tidak disterilisasi pada medium PDA, medium tanpa sampel kemudian diinkubasi serta kontrol ruangan yang disimpan didalam LAF selama pengerjaan.
III.2.6 Pemurnian Fungi Endofit
Asam tartrat 10% sebanyak 0,2 ml dimasukkan ke dalam cawan petri steril, lalu medium PDA steril dituang ke dalam cawan petri tersebut sebanyak ±20 ml, homogenkan dan ditunggu hingga memadat. Koloni yang tumbuh dipotong ukuran ±1 cm2 menggunakan jarum inokulasi dan ditempelkan di atas medium PDA tersebut. Inkubasi pada suhu 25˚C selama 7x24 jam. Hal ini terus dilakukan hingga diperoleh isolat murni (tunggal).
III.2.7 Peremajaan Kultur Murni Fungi Uji
Medium agar miring dibuat dengan cara 0,1 ml asam tartrat 10%
dan medium PDA steril sebanyak ±10 ml dituang ke dalam tabung reaksi steril, homogenkan menggunakan vortex, kemudian dimiringkan hingga memadat.
Masing-masing sebanyak 1 ose kultur murni fungi uji (C. albicans dan A. niger) digoreskan menggunakan jarum inokulasi pada medium tersebut lalu diinkubasi pada suhu 25˚C selama 3x24 jam.
III.2.8 Uji Antagonis
III.2.8.1 Uji Antagonis pada Fungi Uji Candida albicans
Fungi uji C. albicans yang telah diremajakan diambil sebanyak 1 ose dan disuspensikan dalam tabung reaksi steril yang telah berisi 10 ml NaCl 0,9% steril, homogenkan menggunakan vortex.
32
Asam tartrat sebanyak 0,2 ml dan 0,1 ml suspensi fungi uji masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril, lalu medium PDA steril sebanyak ±20 ml dituang ke dalam cawan petri tersebut. Homogenkan dan ditunggu hingga memadat. Lempeng agar yang berisi isolat murni dipotong ukuran ±1 cm2 menggunakan jarum inokulasi dan ditempelkan di atas medium PDA tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 25˚C selama 3x24 jam. Kemampuan isolat dalam menghambat fungi uji ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar isolat.
III.2.8.2 Uji Antagonis pada Fungi Uji Aspergillus niger
Asam tartrat sebanyak 0,2 ml dimasukkan ke dalam cawan petri steril, lalu medium PDA steril dituang ke dalam cawan petri tersebut sebanyak ±20 ml. Homogenkan dan ditunggu hingga memadat.
Lempeng agar yang berisi isolat murni dipotong ukuran ±1 cm2 menggunakan jarum inokulasi dan ditempelkan di atas medium PDA tersebut yang telah memadat dibagian sebelah kiri dan hasil peremajaan fungi uji A. niger diambil sedikit menggunakan jarum inokulasi lurus, lalu diletakkan disebelah kanan diatas medium tersebut. Inkubasi pada suhu 25˚C selama 5x24 jam. Kemampuan isolat dalam menghambat fungi uji ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar isolat.
III.2.9 Peremajaan Isolat Fungi Endofit Daun Talas
Asam tartrat sebanyak 0,2 ml dimasukkan ke dalam cawan petri steril, lalu medium PDA steril dituang ke dalam cawan petri tersebut
sebanyak ±20 ml, homogenkan dan ditunggu hingga memadat. Lempeng agar yang berisi isolat murni dipotong ukuran ±1 cm2 menggunakan jarum inokulasi dan ditempelkan di atas medium PDA tersebut. Inkubasi pada suhu 25˚C selama 7x24 jam.
III.2.10 Identifikasi Mikroskopik
Isolat aktif dilanjutkan ke tahap identifikasi mikroskopik untuk mengetahui struktur anatomi isolat fungi endofit. Air steril diteteskan sebanyak ±0,2 ml pada objek glass lalu isolat fungi endofit diambil menggunakan jarum inokulasi bulat dan disuspensikan pada air di objek glass tersebut. Preparat dikeringkan dan difiksasi dengan cara melewatkan pada nyala api bunsen, perlu dijaga agar tempat gesekan sampel tidak langsung kena nyala api. Setelah mengering, dilakukan pewarnaan dengan cara meneteskan pewarna Lacto Phenol Blue sebanyak ±0,5 ml pada preparat dan didiamkan selama 1 menit. Objek glass dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan menggunakan kertas saring. Preparat kemudian diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 400x dan pembesaran 1000x yang sebelumnya telah diteteskan minyak imersi sebanyak ±0,3 ml.
III.2.11 Fermentasi Isolat Fungi Endofit Daun Talas III.2.11.1 Pembuatan Medium Fermentasi
Medium fermentasi yang digunakan yaitu medium Potato Dextrose Yeast (PDY). Cara membuatnya yaitu ditimbang 4,8 gram Potato Dextrose
34
Broth (PDB) dan 2 gram extract yeast sebanyak lima kali penimbangan,
lalu dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 200 ml aquadest. Dibuat juga medium cuplikan dengan cara ditimbang 2,4 gram medium PDB dan 1 gram extract yeast sebanyak dua kali penimbangan, lalu dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 250 ml dan ditambahkan 100 ml aquadest. Panaskan hingga larut dan sterilkan pada suhu 121˚C selama 15 menit.
III.2.11.2 Pengerjaan Fermentasi Isolat
Asam tartrat sebanyak 3 ml dan 2 ml dimasukkan ke dalam medium fermentasi dan medium cuplikan yang telah steril, kocok hingga homogen.
Isolat fungi endofit yang telah diremajakan sebanyak 6 cawan petri masing-masing dimasukkan 1 cawan petri isolat peremajaan ke dalam medium fermentasi dan 1⁄2 cawan petri isolat peremajaan ke dalam medium cuplikan yang terlebih dahulu telah dipotong-potong kecil. Kocok hingga homogen. Inkubasi pada suhu 25ºC selama 16x24 jam sambil dikocok menggunakan shaker selama ±60 menit setiap hari. Setelah dikocok, medium cuplikan dicuplik sebanyak 1000 µl hingga hari ke-16, lalu disimpan di dalam tabung effendorf dan freezer untuk digunakan pada tahap uji aktivitas fermentasi isolat.
III.2.12 Uji Aktivitas Fermentasi Isolat
Hasil cuplikan fermentasi hingga hari ke-16 di uji pada fungi uji C.
albicans dan A. niger dengan metode sumuran. Sebagai lapisan dasar
(base layer), sebanyak 0,2 ml asam tartrat dimasukkan ke dalam cawan
petri steril, lalu medium PDA steril dituang ke dalam cawan petri tersebut sebanyak ±20 ml, homogenkan dan ditunggu hingga agak memadat.
Pada permukaan lapisan dasar diletakkan 12 buah pencadang yang diatur jaraknya agar daerah pengamatan tidak saling bertumpuk, ditunggu hingga memadat.
Suspensi fungi uji dibuat dengan cara fungi uji yang telah diremajakan (C. albicans dan A. niger) masing-masing diambil sebanyak 1 ose dan disuspensikan masing-masing dalam tabung reaksi steril yang telah berisi 10 ml NaCl 0,9% steril, homogenkan menggunakan vortex.
Lapisan kedua (seed layer) dibuat dengan cara sebanyak 0,1 ml asam tartrat dan 0,1 ml suspensi fungi uji masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, lalu medium PDA steril sebanyak ±10 ml dituang ke dalam tabung reaksi tersebut. Homogenkan menggunakan vortex. Setelah homogen, dituang ke dalam cawan petri yang berisi pencadang, ditunggu hingga memadat. Pencadang diangkat dari medium dalam cawan petri tersebut menggunakan pinset, lalu setiap sumuran pada cawan petri ditetesi sebanyak 30 µl hasil cuplikan mulai hari ke-1 hingga hari ke-16. Inkubasi pada suhu 25ºC selama 3x24 jam
III.2.13 Ekstraksi Hasil Fermentasi
Biomassa (miselia fungi) dipisahkan dari cairan fermentasi dengan cara filtrasi menggunakan kain saring steril.
36
III.2.13.1 Ekstraksi Cairan Fermentasi Fungi Endofit Isolat TL
Cairan fermentasi diekstraksi mengikuti metode ekstraksi cair-cair menggunakan corong pisah, ditambahkan pelarut etil asetat dengan jumlah sama banyak dengan jumlah cairan fermentasi yaitu sebanyak 200 ml cairan fermentasi dimasukkan ke dalam corong pisah, lalu ditambahkan pelarut etil asetat sebanyak 200 ml (1:1 v/v), kocok selama 20 menit dan diamkan hingga terbentuk dua lapisan. lapisan atas (supernatan) dikeluarkan dari corong pisah dan pada lapisan bawah (residu) diekstraksi kembali dengan pelarut etil asetat seperti langkah sebelumnya. Lapisan atas yang diperoleh diuapkan dan disimpan pada desikator hingga seluruh pelarutnya menguap dan diperoleh ekstrak kering etil asetat. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali.
Residu dituang ke dalam cawan petri plastik sebanyak 100 ml.
Sampel dibekukan menggunakan freezer dengan suhu -20˚C, lalu sampel dimasukkan ke dalam alat freeze drying yang telah diatur sebelumnya dengan suhu -40˚C selama 2x24 jam hingga diperoleh ekstrak kering air.
III.2.13.2 Ekstraksi Biomassa Fermentasi Fungi Endofit Isolat TL Biomassa (miselia fungi) dihancurkan terlebih dahulu menggunakan lumpang. lalu diekstraksi dengan metode maserasi dengan cara biomassa sebanyak 59 gram dimasukkan ke dalam toples dan ditambahkan pelarut metanol sebanyak 590 ml (1:10 b/v), lalu diaduk. Diamkan hingga 3x24 jam sambil diaduk setiap hari. Setelah 3x24 jam, saring hingga diperoleh supernatan. Supernatan diuapkan sedangkan biomassa diekstraksi
kembali dengan metanol seperti langkah sebelumnya. Ekstrak metanol yang diperoleh disimpan pada desikator hingga seluruh pelarutnya menguap dan diperoleh ekstrak kering metanol. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali.
III.2.14 EkstraksiDaun Talas
Ekstrak dari daun talas dibuat sebagai pembanding pada saat uji aktivitas antifungi terhadap ekstrak dari isolat fungi endofit kode TL. Tahap ini diawali dengan pembuatan simplisia daun talas. Daun talas yang digunakan yang telah tua ditandai dengan tumbuhan talas yang telah menghasilkan umbi. Daun talas yang telah dikumpulkan disortasi basah, lalu dibersihkan dan dikeringkan. Simplisia yang telah kering kemudian dihaluskan menggunakan blender lalu diayak menggunakan ayakan mesh no.20 hingga diperoleh serbuk simplisia.
Serbuk simplisia yang diperoleh ditimbang sebanyak 50 gram dan dimasukkan ke dalam toples bersih, lalu ditambahkan pelarut etil asetat sebanyak 500 ml (1:10 b/v), lalu diaduk. Diamkan hingga 3x24 jam sambil diaduk setiap hari. Setelah 3x24 jam, saring hingga diperoleh supernatan.
Supernatan diuapkan sedangkan residu diekstraksi kembali dengan menambahkan pelarut etil asetat sebanyak 400 ml dan dikerjakan seperti langkah sebelumnya. Supernatan yang diperoleh disimpan pada desikator hingga seluruh pelarutnya menguap dan diperoleh ekstrak kental etil asetat dari daun talas.
38
III.2.15 Uji Aktivitas Antifungi
Kultur murni fungi uji (C. albicans dan A. niger ) diremajakan pada medium PDA selama 3x24 jam, kemudian sebanyak satu ose disuspensikan pada 10 ml NaCl 0,9% steril.
Uji aktifitas antifungi dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar menggunakan sumuran. Asam tartrat 10% sebanyak 0,1 ml dan medium PDA steril sebanyak 15 ml dituang ke dalam cawan petri secara merata, dibiarkan hingga memadat sebagai lapisan dasar (base layer).
Setelah memadat, pada permukaan lapisan dasar diletakkan enam buah pencadang yang diatur jaraknya agar daerah pengamatan tidak saling bertumpuk. Asam tartrat 10% dan suspensi fungi uji sebanyak 0,1 ml masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril lalu sebanyak 10 ml medium PDA dimasukkan kedalam tabung reaksi tersebut, homogenkan menggunakan vortex. Setelah homogen tuang ke dalam cawan petri berisi pencadang sebagai lapisan kedua (seed layer) hingga memadat. Selanjutnya pencadang diangkat dari cawan petri menggunakan pinset. Setiap sumuran diteteskan sebanyak 30 µl masing-masing ekstrak dengan kadar 4 mg.
Pada sumuran pertama diteteskan sebanyak 30 µl ekstrak etil asetat dari fungi endofit kode TL yang telah dilarutkan sebelumnya dengan cara sebanyak 50 mg ekstrak etil asetat dari fungi endofit kode TL ditambahkan 75,8 µl DMSO, lalu divortex hingga larut, kemudian ditambahkan air steril sebanyak 299 µl, homogenkan.
Pada sumuran kedua, diteteskan sebanyak 30 µl ekstrak metanol dari fungi endofit kode TL yang telah dilarutkan sebelumnya dengan cara sebanyak 113,1 mg ekstrak metanol dari fungi endofit kode TL ditambahkan 171,4 µl DMSO, lalu divortex hingga larut, kemudian ditambahkan air steril sebanyak 676,9 µl, homogenkan.
Pada sumuran ketiga, diteteskan sebanyak 30 µl ekstrak air dari fungi endofit kode TL yang telah dilarutkan sebelumnya dengan cara sebanyak 172,8 mg ekstrak air dari fungi endofit kode TL ditambahkan 1290 µl air steril, lalu divortex hingga larut.
Pada sumuran keempat, diteteskan sebanyak 30 µl ekstrak etil asetat dari daun talas yang telah dilarutkan sebelumnya dengan cara sebanyak 109,1 mg ekstrak etil asetat dari daun talas ditambahkan 165,3 µl DMSO, lalu divortex hingga larut, kemudian ditambahkan air steril sebanyak 653 µl, homogenkan.
Pada sumuran kelima, diteteskan sebanyak 30 µl kontrol positif yaitu nistatin suspensi dengan konsentrasi 150 IU/30 µL. Cara membuatnya yaitu sebanyak 20 µl nistatin dimasukkan ke dalam vial dan ditambahkan 380 µl air steril.
Pada sumuran keenam, diteteskan sebanyak 30 µl kontrol negatif yaitu DMSO 20%. Cara membuatnya yaitu sebanyak 101 µl DMSO 99%
dimasukkan ke dalam vial dan ditambahkan 399 µl air steril. Diinkubasi pada suhu 25˚C selama 3x24 jam. Setelah masa inkubasi selesai, dilakukan pengamatan terhadap zona bening yang terbentuk dan diukur
40
diameternya menggunakan jangka sorong. Pengujian setiap ekstrak dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dan hasilnya dirata-ratakan.
III.2.16 Skrining Fitokimia
Ekstrak etil asetat, ekstrak metanol dan ekstrak air dari fungi endofit kode TL serta ekstrak etil asetat daun talas selanjutnya dilanjutkan ke tahap uji skrining fitokimia untuk mengetahui golongan senyawa bioaktif yang terdapat dalam ekstrak secara kualitatif dengan menggunakan lempeng KLT silika gel GF-254 yang telah diaktifkan, lalu dibuat konsentrasi 10% untuk ekstrak etil asetat fungi endofit isolat TL dengan cara sebanyak 20 mg dilarutkan dengan pelarut etil asetat sebanyak 2 ml.
Ekstrak metanol fungi endofit isolat TL dibuat juga konsentrasi 10%
dengan cara sebanyak 50 mg dilarutkan dengan pelarut metanol sebanyak 5 ml. Untuk ekstrak air fungi endofit isolat TL dibuat konsentrasi 13% dengan cara sebanyak 78 mg dilarutkan dengan aquadest sebanyak 6 ml, sedangkan ekstrak etil asetat dari daun talas dibuat konsentrasi 0,5% dengan cara sebanyak 9,6 mg dilarutkan dengan pelarut etil asetat sebanyak 9,6 ml. Homogenkan menggunakan vortex.
Eluen pengembang KLT dibuat dengan cara sebanyak 6 ml pelarut etil asetat dan 0,5 ml pelarut metanol dimasukkan ke dalam wadah chamber yang telah dilengkapi dengan penutupnya, gojok hingga homogen. Dimasukkan kertas saring ke dalam chamber tersebut. Siapkan Plat KLT normal phase silika gel GF-254 ukuran 2,5cm x 7cm dengan garis dasar (base line) 0,8 cm dibagian bawah plat dan 0,2 cm garis akhir
dibagian atas plat. keempat ekstrak tersebut ditotolkan di tengah garis base line dengan 0,3 cm dari setiap ekstrak menggunakan pipa kapiler, lalu keringkan totolan. Tempelkan plat pada chamber berisi eluen tadi, ditunggu hingga eluen mengelusi sampai mencapai garis akhir. Keluarkan plat dari chamber menggunakan pinset, ditunggu hingga plat kering. Amati noda menggunakan UV 254 nm dan 366 nm, lalu semprot menggunakan H2SO4 10%. Ulangi perlakuan sebanyak 5 kali dan masing-masing plat KLT disemprot dengan pereaksi vanillin, sitroborat, Dragendorff, Lieberman-Burchard, dan besi (III) klorida, lalu dipanaskan menggunakan mantle heat kecuali pereaksi Dragendorff dan vanilin. Amati noda yang
terbentuk.
Ekstrak air diidentifikasi golongan senyawa secara kualitatif menggunakan metode Lowry. Pereaksi A disiapkan dengan mencampurkan 50 ml larutan (2% Na2CO3 + 0,1 N NaOH) + 1 ml larutan (1% CuSO4 + 1% Na-K-Tartrat) dalam air. Sedangkan pereaksi B disiapkan dengan mencampurkan pereaksi Folin Ciocalteau dengan akuadest (1:1). Ekstrak air dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan pereaksi A sebanyak 2,5 ml kemudian dihomogenkan dan diinkubasi selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan pereaksi B sebanyak 250 µL ke dalam tabung reaksi yang sama dan diinkubasi selama 30 menit, lalu dilakukan pengamatan adanya protein (peptida) pada sampel secara visual dengan hasil positif perubahan warna larutan menjadi berwarna biru.
42