Penelitian ini dilaksanakan selama empat bulan yaitu pada awal Juni sampai akhir Oktober 2008 di PT. IndoAnilab Jalan Taman Kencana No. 3 dan Laboratorium Patologi dan Lipid, Pusat Studi Satwa Primata-IPB (PSSP-IPB) di Jalan Lodaya II No. 5, Bogor.
Materi Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 15 ekor monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) dewasa berjenis kelamin jantan dengan bobot badan berkisar antara 3–6 kg, dengan umur 6–8 tahun. Seluruh monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) yang digunakan berasal dari Sumatera dan bebas dari penyakit tuberkulosis dan simian retrovirus (SRV). Seluruh perlakuan yang melibatkan hewan percobaan dilakukan berdasarkan peraturan yang telah ditentukan oleh Animal Care and Use Commitee (ACUC) yaitu Komisi Kesejahteraan Hewan Percobaan dari PT. IndoAnilab dengan nomor protokol: 02-IA-ACUC-08.
Kandang
Kandang yang digunakan adalah kandang individu stainless steel (squeeze back cage) untuk mempermudah dalam pemeliharaan dan pengendalian. Kandang dengan ukuran 0,6 x 0,6 x 0,9 m dapat dilihat dalam Gambar 3.
20 Peletakan kandang dibuat dalam bentuk satu sama lain individu masih dapat
saling melihat dan mendengar. Setiap kandang dilengkapi dengan tempat pakan dan tempat air minum berupa mangkuk yang terbuat dari logam anti karat dan air minum disediakan adlibitum, ditempatkan pada ruang tertutup dan bersih serta dilengkapi dengan lampu, keran air, selang air, alat kebersihan dan house fan.
Pakan Penelitian
Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) jantan telah mengkonsumsi pakan formulasi selama empat bulan dan selama penelitian empat bulan berikutnya monyet tersebut tetap mendapat pakan formulasi yang sama. Pakan formulasi dibuat dari bahan pakan lokal berenergi tinggi dan diformulasi sebanyak 100-150 g/ekor/hari. Bahan pakan terdiri dari gandum, gula, tallow (lemak sapi), minyak goreng, tepung ikan, tepung maizena, bungkil kedelai, dedak padi, agar-agar, CMC (carboxymethyl cellulose), Premix®, kalsium karbonat, kalsium fosfat serta kuning telur. Komposisi dari formulasi pakan A dan pakan B dapat dilihat dalam Tabel 7.
Tabel 7. Komposisi Pakan A dan Pakan B yang Digunakan dalam Penelitian
Bahan Pakan Pakan A Pakan B
--- (%) --- Gandum Gula Minyak goreng Tepung ikan Tepung maizena Bungkil kedelai Dedak padi Agar-agar CMC (carboxymethyl cellulose) Mineral mix Kuning telur Tallow 42,0 10,0 10,0 6,5 8,0 5,0 4,0 1,5 1,0 2,0 - 10,0 42,0 8,0 10,0 4,0 8,0 4,0 4,0 1,0 1,0 2,0 10,0 6,0 Keterangan: - Tidak diberikan
Perlakuan pakan formulasi ini menggunakan lima ekor monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) jantan yang diberi pakan A yaitu pakan dengan formula yang mengandung bahan sumber energi dari gandum dan dikombinasi dengan tallow,
21 sedangkan lima ekor lainnya mendapat pakan B yaitu terbuat dari bahan sumber
energi gandum dan tallow yang dikombinasikan dengan kuning telur. Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) jantan sebanyak lima ekor mendapat pakan komersial buatan Bangkok dengan merk dagang monkey chow sebanyak 50-80 g/ekor/hari. Monkey chow berbentuk biskuit padat, kering dan agak keras yang kandungan protein dan energi tinggi. Kandungan zat-zat makanan dalam pakan A, pakan B dan pakan monkey chow dapat dilihat dalam Tabel 8.
Tabel 8. Hasil Analisis Proksimat Kandungan Nutrisi Pakan Perlakuan
No Nutrisi Pakan A Pakan B Pakan C
(lemak sapi) (lemak sapi dan kuning telur) (monkey chow)
1 2 1 2 1 2 1 Bahan Kering (%) 68,09 100 70,18 100 92,75 100 2 Kadar abu (%) 4,73 6,95 3,89 5,54 7,65 8,25 3 Protein Kasar (%) 14,42 21,18 15,01 21,39 29,39 31,69 4 Serat Kasar (%) 1,81 2,66 1,14 1,62 6,02 6,49 5 Lemak Kasar (%) 19,62 28,81 19,62 27,96 5,55 5,98 6 BETN (%) 59,62 87,56 60,34 85,98 51,38 55,40 7 Ca (%) 1,41 2,07 1,25 1,78 1,66 1,79 8 P (%) 0,65 0,95 0,58 0,83 1,55 1,67
9 Gross energi (Kal/kg) 4,48 6,58 4,21 6,00 4,33 4,67 Keterangan : 1 = jumlah aktual
2 = jumlah berdasarkan 100% bahan kering setiap unsur nutrisi
Hasil analisis proksimat Laboratorium Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, 2008 Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) selain mendapat pakan di atas juga mendapat pakan tambahan berupa buah pisang (± 70 g/ekor/hari) dan untuk menarik minat monyet mengkonsumsi pakan formulasi maka dilakukan pengkayaan lingkungan (environmental enrichment) dengan cara diberi tambahan buah jeruk, pepaya dan jambu biji (± 10 g/ekor/hari) yang telah dibekukan dalam air yang dibekukan secara bergantian setiap pagi hari sebelum diberi pakan. Bentuk pakan yang digunakan selama penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.
22
a b c
Keterangan : a. Pakan Perlakuan A b. Pakan Perlakuan B
c. Pakan Komersial (monkey chow)
Gambar 4. Bentuk Pakan yang Digunakan dalam Penelitian
Bentuk fisik pakan A yaitu berwarna cokelat kemerahan dan dibentuk bulat lonjong dengan tekstur lembek dan agak kasar, sedangkan pakan B berwarna cokelat dan dibentuk bulat lonjong dengan tekstur lembek namun lebih lembut (kalis) daripada pakan A. Pakan monkey chow berwarna coklat kekuningan dan berbentuk pipih, lonjong dan keras (kering).
Pemeriksaan Darah
Bahan yang digunakan dalam pengambilan darah yaitu ketamin 5–25 mg/kg alkohol 70% dan indikator tuberkulosis. Bahan yang digunakan dalam analisis darah adalah contoh darah, alkohol 70%, Giemsa 10%, metanol dan minyak imersi.
Alat yang digunakan adalah syringe 5 ml, mikroskop cahaya (merek Nikon YB100), tabung vacum dengan larutan EDTA K3 (merek Ges Vacuum Tube), kotak pendingin, alat penghitung manual, kaca objek (merek Sail Brand), kaca penutup preparat, pipet mikro dan alat analisis darah (merek Nihon Kohden, Celltax) dapat dilihat pada Gambar 5.
23 Gambar 5. Alat Analisis Darah merek Nihon Kohden, Celltax
Bahan yang digunakan dengan analisis manual adalah contoh darah yang akan dianalisis, aquadestilata, alkohol 70%, larutan EDTA, larutan Hayem, HCl 0,1 N, Giemsa 10%, natrium sitrat 3,8 g, formaldehida 40% 0,2 ml, brilliant cresyl blue 0,1 g, air destilasi 100 ml dan metanol. Alat yang digunakan adalah syringe 5 ml, pipet Sahli (0,02 cc), tabung Sahli, mikroskop, kapas, colin jar, kertas filter, crestaseal, hemositometer, sentrifuse, hemoglobinometer, hand counter, gelas penutup, pipet BDM, buluh kapiler yang mengandung antikoagulan, pipet Pasteur dan skala untuk membaca nilai hematokrit.
Rancangan
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap pola tersarang dengan faktor perlakuan pemberian pakan (A, B dan C) dan periode pengambilan data tersarang pada perlakuan. Rancangan ini seolah-olah terdiri dari dua atau lebih rancangan acak lengkap yang responsnya sama kemudian digabung menjadi satu model percobaan. Transformasi arcsin dilakuakan untuk data diferensiasi leukosit yang datanya dibawah nilai 30%. Pengolahan data dan perhitungan peubah yang berpengaruh nyata dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan menggunakan program aplikasi SAS. Model persamaan rancangan acak lengkap pola tersarang (Gasperz, 1992) yaitu
24 Yij = µ + τ i + β j(i) + ε ijk
Keterangan:
i = 1, 2, 3 dan j = 1, 2, 3, 4
Yij = pengamatan faktor τ taraf ke-i, faktor β taraf ke-j dan ulangan ke-k, µ = rataan umum,
τ i = pengaruh faktor τ pada taraf ke-i,
β j(i) = pengaruh faktor β pada taraf ke-j tersarang pada taraf ke-i dan
ε ijk =pengaruh galat faktor τ taraf ke-i, faktor β taraf ke-j dan ulangan ke-k. Analisis korelasi dilakukan untuk mengetahui keeratan hubungan anatar peubah. Koefisien korelasi antara dua peubah dapat dicari dengan rumus (Mattjik dan Sumertajaya, 2002) sebagai berikut
Keterangan :
r XY = koefisien korelasi, n = jumlah data, xi = peubah x ke i dan yi = peubah y ke i.
Peubah yang diamati adalah nilai hematologi darah diantaranya jumlah sel darah merah (juta/ml), kadar hemoglobin (g/dl), nilai hematokrit (%), nilai Mean Corpuscular Volume (MCV) (fl), nilai Mean Corpusular Hemoglobin (MCH) (ρg) dan nilai Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC) (g/dl) dan diferensiasi leukosit (neutrofil, eosinofil, basofil, limfosit dan monosit).
Prosedur Prosedur Umum
Peneliti diwajibkan memenuhi persyaratan kesehatan sebelum melakukan penelitian berupa röntgen toraks dan mendapat surat keterangan sehat. Peneliti maupun petugas kandang wajib menerima materi pelatihan dan memakai pakaian kandang khusus lengkap dengan kacamata, sarung tangan, masker, penutup kepala serta sepatu boot. Sebelum memasuki ruang kandang, sepatu boot dicelupkan ke dalam cairan desinfektan.
25 Pengambilan Contoh Darah
Pengambilan contoh darah dan analisis darah dilakukan pada bulan ke–5, ke–6, ke–7 dan ke–8 penelitian. Sebelum darah diambil, monyet dibius terlebih dahulu dengan ketamin 5–25 mg/kg secara intramusculer (Fortman et al., 2002). Darah diambil di daerah vena femoralis menggunakan syringe 5 ml dan dimasukan ke dalam tabung vakum yang berisi antikoagulan EDTA K3. Sampel darah dimasukkan ke dalam kotak pendingin agar darah tetap dalam kondisi baik dan dibawa ke laboratorium.
Pengumpulan Data Jumlah Sel Darah Merah
Perhitungan jumlah sel darah merah dilakukan pada kamar hitung eritrosit dengan menggunakan mikroskop pembesaran 100 kali (objektif 10 kali dan okuler 10 kali). Prosedur pengerjaannya adalah aspirator dipasang pada pipet eritrosit lalu darah dihisap sampai batas angka 0,5 pada pipet. Ujung pipet dibersihkan dengan menggunakan tisu. Larutan Hayem dengan cepat dan hati-hati dihisap sampai tanda 101 yang tertera pada pipet. Pada penghisapan ini dihindari terbentuknya gelembung udara, jika terdapat gelembung udara maka prosedur harus diulang. Selanjutnya aspirator dilepas dari pipet eritrosit.
Ibu jari dan telunjuk kanan digunakan untuk memegang kedua ujung pipet, lalu isi pipet dikocok dengan membuat gerakan angka 8 selama 3 menit. Bagian yang tidak ikut terkocok dibuang. Selanjutnya dengan hati-hati cairan dimasukan ke dalam kamar hitung dengan cara menempelkan ujung pipet pada pertemuan antara dasar kamar hitung dan kaca penutup. Butir-butir darah dibiarkan mengendap selama kurang lebih satu menit. Agar tidak terjadi penghitungan yang berulang sebaiknya digunakan hand counter.
Menghitung eritrosit dalam hemositometer, digunakan kotak eritrosit yang berjumlah 25 buah dengan mengambil bagian satu kotak pojok kanan atas, satu kotak pojok kiri atas, satu kotak di tengah, satu kotak di pojok kanan bawah dan satu kotak di pojok kiri bawah dan untuk membedakan kotak eritrosit dengan kotak leukosit dapat berpatokan pada tiga garis pemisah pada kotak eritrosit. Luas kotak eritrosit relatif lebih kecil dibandingkan dengan kotak leukosit. Setelah jumlah eritrosit didapatkan maka jumlah darah merah dikalikan dengan 104, untuk mengetahui jumlah eritrosit dalam 1 mm3 darah (Sastradipraja et al., 1989).
26 Pengumpulan Data Kadar Hemoglobin
Metode yang digunakan untuk uji kadar hemoglobin adalah metode Sahli. Larutan HCl 0,1 N diteteskan pada tabung Sahli sampai angka 10 atau garis bawah, kemudian sampel darah dihisap menggunakan pipet hingga mencapai batas garis 20 mm3 (0,02 cc). Sampel darah segera dimasukkan ke dalam tabung dan ditunggu selama 3 menit atau hingga berubah warna menjadi coklat kehitaman akibat reaksi antara HCl dengan hemoglobin membentuk asam hematid. Larutan ditambah dengan aquadestilata, teteskan sedikit demi sedikit sambil terus diaduk. Aquadestilata ditambah hingga warna larutan sama dengan warna standar hemoglobinometer. Kadar hemoglobin dapat dilihat di kolom g % yang tertera pada tabung hemoglobin (Sastradipraja et al., 1989).
Pengumpulan Data Nilai Hematokrit
Nilai hematokrit secara manual yaitu dengan pengisian pipa mikrometer yang dilakukan dengan memiringkan tabung yang berisi sampel darah dengan menempatkan ujung mikrokapiler yang bertanda merah. Pipa diisi sampai mencapai 2/3 bagian, kemudian ujung pipa disumbat dengan crestoseal dan pipa mikrokapiler tersebut disentrifusi selama 15 menit dengan kecepatan 2.500–4.000 rpm. Bagian yang tersumbat diletakkan menjauhi pusat sentrifuse. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur persentase volume eritrosit dengan menggunakan alat baca mikrohemotokrit (microcapillary hematocrit reader) (Sastradipraja et al., 1989). Perhitungan Nilai Mean Corpuscular Volume (MCV), Mean Corpuscular Hemoglobin (MCH) dan Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC)
McGill Virtual Lab (2009) menghitung nilai MCV, MCH dan MCHC, digunakan rumus berikut :
MCV (fl) = Hematokrit (%) x 10 Jumlah sel darah merah (106/ml)
MCH (ρg) = Hemoglobin (g/dl) x 10 Jumlah sel darah merah (106/ml)
MCHC (g/dl) = Hemoglobin (g/dl) x 100 Hematokrit (%)
Satuan untuk MCV, MCH dan MCHC secara berturut-turut adalah femtoliters (fl, 1 fl = 10-15 liter), picograms (ρg) dan gram per desiliter (g/dl).
27 Pengumpulan Data Jumlah Sel Darah Merah, Kadar Hemoglobin, Nilai
Hematokrit, MCV, MCH, MCHC Menggunakan Alat (Hematology Analyzer) Perhitungan jumlah sel darah merah (×106/ml), konsentrasi hemoglobin (g/dl) dan nilai hematokrit (%) dilakukan dengan alat analisis darah secara bersamaan. Alat diatur sesuai kehendak dan dipastikan dalam kondisi baik dengan diuji kontrol. Sampel darah dari tabung vacutainer diuji satu per satu. Hasil dari pembacaan akan tampil pada layar dan tersimpan di memory alat.
Pengumpulan Data Diferensiasi Leukosit
Darah yang telah disiapkan diteteskan ke kaca objek yang dipegang dengan ibu jari dan telunjuk salah satu tangan. Kaca penutup berbeda dipegang tangan lainya kemudian ujung kaca penutup ditempelkan dengan membentuk sudut kurang lebih 30o setelah itu, kaca penutup didorong dengan kecepatan konstan sehingga didapatkan ulasan yang tidak terlalu tebal. Ulasan dikeringkan selama beberapa menit. Lalu ulasan difiksasi dalam metanol selama 5–10 menit. Ulasan dicelupkan ke dalam pewarna Giemsa sekitar 30 menit kemudian ulasan diangkat dan dicuci menggunakan air mengalir sampai air bilasan tidak membawa warna Giemsa. Preparat ulas dikeringkan dan perhitungan dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan ditetesi minyak imersi, perbesaran 100 x 10 (Sastradipraja et al., 1989).
HASIL DAN PEMBAHASAN