BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN
4.5 Metode Penatalaksanaan Penelitian
4.5.1 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah
1. Daun Afrika (Vernonia amygdalina) 2 kg yang dipetik dari Kelurahan Hamdan, Medan, Sumatera Utara, Indonesia.
2. Etanol 70% sebanyak 6 liter (Kimia Farma, Indonesia) 3. Akuades 2 liter (Kimia Farma, Indonesia)
4. Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (Laboratorium Rumah Sakit Khusus Infeksi, Surabaya, Indonesia)
5. Mueller Hinton Agar (Difco, USA)
6. NaCl 0,9% (Kimia Farma, Indonesia)
4.5.2 Alat Penelitian
1. Timbangan (Home Line, China) 2. Timbangan analitik (Vibra, Japan)
3. Kertas perkamen 3 kajang 4. Blender (Panasonic, Japan)
5. Kapas 250gram (Bio Panca, Indonesia) 6. Kertas saring (Whatman no.42, England)
7. Aluminium foil 1 gulungan (Total Wrap, Indonesia) 8. Perkolator
9. Erlenmeyer (Pyrex, USA)
10. Vacuum rotary evaporator (Stuart, 2010) 11. Electronic balance (Sartorius, Germany) 12. Autoklaf (Tomy, Japan)
13. Densichek (bioMérieux, USA) 14. Vortex (Stuart, Japan)
15. Inkubator CO2 (Sanyo, Japan)
16. Mikropipet (Gilson, France) 17. Piring petri (Pyrex, Japan) 18. Ose dan spiritus
19. Kaca pembesar (Ootsuka ENV-CL, Japan)
4.5.3 Prosedur Penelitian
4.5.3.1 Pembuatan ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina)
Proses pembuatan ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) dilakukan berdasarkan Standart Operasional Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU dengan langkah-langkah sebagai berikut:
a. Pembuatan simplisia
Daun Afrika (Vernonia amygdalina) dipetik dan ditimbang sebanyak 2 kg (Gambar 6). Daun Afrika dicuci dengan air mengalir, kemudian dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40oC (Gambar 7). Daun Afrika dikatakan sudah mengering apabila daun diremas akan mudah hancur. Daun Afrika (Vernonia amygdalina) yang telah dikeringkan kemudian ditimbang kembali dan diperoleh 300 gram daun Afrika yang telah kering. Selanjutnya daun Afrika tersebut dihaluskan
dengan menggunakan blender (Gambar 8) dan didapat serat-serat halus (simplisia) daun Afrika (Gambar 9).
b. Proses destilasi sederhana etanol
Letakkan etanol 96% dalam labu destilasi kemudian dipanaskan dengan pemanas (heater) yang berada dalam wadah berisi air. Etanol dipanaskan hingga mencapai titik didih etanol yaitu 78oC. Pada suhu 78oC etanol mulai mendidih dan menguap. Uap etanol akan naik ke pendingin (kondensor) spiral, sedangkan uap air berubah menjadi embun dan jatuh kembali ke labu didih. Uap etanol yang berada dalam pendingin diembunkan/didinginkan hingga menjadi cair dan ditampung di dalam labu destilat. Proses destilasi etanol ini akan terus berlangsung hingga kadar etanol dalam labu destilasi habis dan hanya akan menyisakan air. (Gambar 10)
c. Pengenceran etanol
Etanol 96% yang telah didestilasi ditambahkan dengan akuades hingga mencapai 1 liter etanol 70% yang sesuai dengan rumus pengenceran yaitu M1.V1 = M2.V2. Pengenceran dilakukan hingga mencapai volume etanol 70% sebanyak 6 liter. (Gambar 11)
d. Proses maserasi
Sebanyak 300 gram serbuk simplisia diletakkan ke dalam bejana tertutup dan direndam dengan etanol 70% selama 15 menit pada suhu 25oC (Gambar 12).
e. Proses perkolasi
Perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas secukupnya yang telah dibasahi dengan etanol pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas kapas tersebut diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator di mulai dari bagian tengah hingga ke tepi perkolator dengan hati-hati sambil sesekali ditekan. Kemudian etanol 70% dituangkan ke dalam perkolator dan massa disaring dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyaring untuk mengetahui apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam (Gambar 13).
Setelah 24 jam, perkulator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit. Tambahkan berulang-ulang etanol 70% secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia dan diperoleh ekstrak cair.
f. Ekstrak cair (Gambar 14) diuapkan dengan vacuum rotary evaporator pada suhu 40oC hingga konsistensi seperti madu (Gambar 15). Ekstrak yang telah kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik. Setelah itu ekstrak etanol daun Afrika dimasukkan ke dalam botol kaca, lalu disimpan di tempat yang sejuk.
Gambar 6. Penimbangan daun Afrika 2 kg
Gambar 7. Pengeringan daun Afrika
Gambar 8. Daun Afrika yang sudah kering diblender
Gambar 13. Proses perkolasi
Gambar 14. Ekstrak cair daun Afrika
Gambar 12. Proses maserasi
Gambar 10. Proses destilasi etanol 96%
Gambar 11. Pengenceran etanol 96%
4.5.3.2 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Dilusi
Proses pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) dilakukan berdasarkan Standart Operasional Laboratorium Rumah Sakit Khusus Infeksi UNAIR dengan langkah-langkah sebagai berikut:
4.5.3.2.1 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak daun Afrika dalam pelarut etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Muller Hinton Broth (MHB). Ekstrak daun Afrika dalam pelarut etanol dimulai dari konsentrasi 100% karena belum diketahui konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis, jadi pengujian dimulai pada konsentrasi terbesar. Sediakan 6 tabung, pada tabung pertama diberi 2 gr ekstrak kental daun Afrika ditambahkan 2 ml MHB kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks sehingga didapatkan ekstrak etanol daun Afrika dengan konsentrasi 100%. Kemudian dilakukan pengenceran berganda dengan cara mengambil 1 ml dari konsentrasi ekstrak etanol daun Afrika 100% menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung kedua yang telah berisi 1 ml MHB untuk mendapatkan ekstrak etanol daun Afrika 50% (pengenceran berganda) kemudian divorteks. Cara yang sama dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi 25%, 12,5%, 6,25%, dan 3,125% Masing-masing tersebut diberi label sesuai konsentrasinya.
4.5.3.2.2 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media MHA. Sebanyak 34 gram MHA dilarutkan dalam 1 liter akuades kemudian dituangkan pada tabung reaksi (20 ml/tabung reaksi), lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Setelah masak, media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121oC, lalu disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan, media dipanaskan kembali hingga mendidih lalu dituang ke dalam petri. Kemudian media dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak.
4.5.3.2.3 Pembiakan Spesimen
Porphyromonas gingivalis yang digunakan adalah spesimen stem sel
Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang dibiakkan secara murni pada media
MHA dalam suasana anaerob pada inkubator CO2 hingga didapatkan pertumbuhan
yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur (Gambar 16). Ambil sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri lalu disuspensikan dalam larutan 0,9% NaCl hingga diperoleh kekeruhan sesuai 0,5 Mc Farland Standard atau setara dengan jumlah 1 x 108CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit).
4.5.3.2.4 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ektrak etanol daun Afrika yang diuji dalam penelitian ini adalah dimulai dari 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, dan 3,125%. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing- masing tabung bahan coba tersebut kemudian divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam pada inkubator CO2. Tabung dalam pengujian nilai KHM
direplikasi sebanyak 4 kali. Amati kekeruhan, lalu bandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol Mc Farland untuk menentukan nilai KHM, yaitu konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis
dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam.
Gambar 16. Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob
4.5.3.2.5 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil pengujian penentuan nilai KHM dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan menggunakan metode Drop Plate Miles Misra. Dengan metode ini dapat dihitung jumlah bakteri hidup yang telah disuspensikan dalam bahan coba. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dari konsentrasi seperti di atas divorteks dan diambil 50 µl untuk setiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat yaitu Muller Hinton Agar. Petri direplikasikan sebanyak 4 kali replikasi, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering kemudian diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam. Kemudian, dilakukan perhitungan
jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM dengan bantuan kaca pembesar. Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Koloni Porphyromonas gingivalis pada media padat berbentuk bulat dan berwarna putih keruh.
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dibuat rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar (CFU/ml).
Contoh cara perhitungan koloni pada metode Drop Plate Miles Misra adalah a. Pada media padat ditetesi sebanyak 50 µl suspensi bahan coba dengan mikropipet
b. Kemudian dihitung jumlah koloni yang ada dengan menggunakan mikroskop dan didapatkanlah sebanyak 5 koloni.
c. Jadi jumlah bakteri pada bahan coba tersebut adalah 5 x 1 (faktor pengenceran) x 20 (faktor pengali) = 100 CFU/ml
4.5.3.2.6 Penghitungan Koloni Bakteri dengan Serial Dilusi
Pada hasil perhitungan jumlah koloni jika koloni bakteri tidak dapat untuk dihitung (TBUD) maka dapat dilanjutkan dengan metode serial dilusi yaitu pengenceran bertahap secara konstan sehingga jumlah koloni bakteri dapat dihitung. Sediakan 4 tabung yang masing-masing tabung berisi 9 µl 0,9% NaCl, lalu pada tabung pertama tambahkan 1 µl suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet kemudian divorteks. Ambil 1 µl dari tabung pertama dan tambahkan pada tabung kedua kemudian divorteks. Hal ini dilakukan hingga tabung keempat. Tambahkan 1 ml bahan coba pada masing-masing tabung kemudian divorteks. Kemudian tabung diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu,
masing-masing tabung divorteks kemudian diambil 50 µl dan diteteskan pada media padat MHA. Diamkan selama 15-20 menit sampai mengering kemudian diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam dan kemudian dilakukan
perhitungan jumlah koloni bakteri.
