PEMBAHASAN
Penelitian eksperimental laboratorium secara in vitro mengenai ekstrak etanol daun Afrika terhadap Porphyromonas gingivalis dilakukan adalah untuk membuktikan bahwa ekstrak etanol daun Afrika memiliki efek antibakteri dalam menghambat dan membunuh pertumbuhan Porphyromonas gingivalis. Penelitian ini dimulai dengan melakukan identifikasi terhadap daun Afrika yang akan digunakan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Dari hasil identifikasi diperoleh bahwa daun Afrika merupakan salah satu jenis tumbuhan Vernonia amygdalina Del. dengan suku Compositae. Setelah dilakukan pengidentifikasian dilanjutkan dengan pembuatan ekstrak daun Afrika dengan menggunakan 300 gram serbuk simplisia daun Afrika yang dilarutkan dengan pelarut etanol 70% hingga diperoleh hasil ekstrak etanol daun Afrika sebanyak 93,083 gram yang diperkirakan cukup sebagai bahan coba dalam pengujian aktivitas antibakteri terhadap Porphyromonas gingivalis.
Uji aktivitas antibakteri pada dasarnya dapat dilakukan dengan dua metode konvensional yaitu metode difusi (disk diffussion method) dan metode dilusi (conventional dilution method). Metode difusi dilakukan menggunakan paper disk
yang diberikan bahan coba antibakteri dengan berbagai konsentrasi dan mengukur diameter zona bening (clear zone) yang merupakan petunjuk adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri. Zona bening yang menjadi zona hambat pada metode difusi ini tergantung dari kelarutan dan difusi bahan coba pada media sehingga kemungkinan kurang efektif dalam menginhibisi mikroorganisme.48 Penelitian dengan metode dilusi dilakukan dengan serangkaian pengenceran berganda sehingga konsentrasi bahan coba yang diuji setengah dari konsentrasi awal.48
Pada penelitian ini dilakukan pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Afrika terhadap Porphyromonas gingivalis dengan menggunakan metode dilusi yang dikombinasikan dengan metode Drop Plate Miles Misra. Dengan metode dilusi ini bahan coba dapat berkontak langsung dengan mikroorganisme sehingga hasil yang
diperoleh lebih akurat dan dapat diketahui nilai KHM dan KBM dari bahan coba. Metode dilusi dilakukan dengan cara pengenceran ganda dari konsentrasi awal sehingga konsentrasi yang didapat adalah setengah dari konsentrasi awal. Konsentrasi yang digunakan dimulai dari konsentrasi terbesar yaitu 100% kemudian dilakukan pengenceran ganda hingga konsentrasi 3,125%. Penentuan konsentrasi tersebut disesuaikan berdasarkan standar konsentrasi pengujian antibakteri yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis UNAIR. Pada penentuan nilai KHM dan KBM, setiap bahan coba dilakukan replikasi sebanyak 4 kali agar diperoleh hasil yang lebih akurat dan mengetahui berapa rata-rata jumlah bakteri yang tumbuh pada ekstrak daun Afrika dalam berbagai konsentrasi karena pada konsentrasi yang sama belum tentu jumlah bakteri yang tumbuh juga sama. Pengujian antibakteri ini menggunakan media Mueller Hinton Broth yang merupakan media standar yang digunakan untuk menguji bakteri pada metode dilusi. MHB memiliki pH, konsentrasi kation dan kandungan thymidine yang terkontrol dengan baik dan memberikan pertumbuhan yang baik pada berbagai jenis mikroorganisme.48
Pengujian efektivitas antibakteri ekstrak etanol daun Afrika diawali dengan mencari nilai KHM. Penentuan nilai KHM dilihat dari konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C yang dapat dilihat secara makroskopik dari hasil biakan pada tabung yang mulai berubah menjadi jernih dengan menggunakan metode dilusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua konsentrasi bahan coba yang diuji ternyata tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih. Hal ini diduga disebabkan karena ekstrak etanol daun Afrika tersebut berupa larutan pekat berwarna hijau kecoklatan sehingga saat disuspensikan dengan bakteri akan berwarna gelap yang menyebabkan kesulitan dalam menentukan pada konsentrasi yang mulai berubah menjadi jernih. Oleh karena itu, semua konsentrasi berwarna keruh dan dianggap tidak representatif untuk mencari nilai KHM sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui nilai KHM dengan menggunakan metode lain seperti metode difusi.
Penentuan nilai KBM dilihat dari konsentrasi minimal bahan uji pada media biakan padat (MHA) yang mampu membunuh seluruh bakteri dan tidak ditemukan pertumbuhan bakteri (steril atau 0 CFU/ml). Pada penelitian ini nilai KBM diperoleh
pada konsentrasi 50% dimana pada konsentrasi ini tidak dijumpai pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pada konsentrasi 25% dan 12,5% mulai memperlihatkan pertumbuhan koloni dengan rata-rata 1,08.1012 CFU/ml dan 1,06.1012 CFU/ml. Konsentrasi 6,25% dan 3,125% juga menunjukkan bakteri yang subur dan tumpang tindih sehingga jumlahnya tidak dapat untuk dihitung (TBUD). Namun penelitian ini memiliki kekurangan disebabkan karena tidak memperkecil rentang antara konsentrasi 25% dengan 50% yang kemungkinan akan memberikan nilai KBM pada konsentrasi yang lebih rendah. Berdasarkan hasil penelitian, maka hipotesis penelitian ini diterima yaitu ada efek antibakteri ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) terhadap Porphyromonas gingivalis
dengan nilai KBM 50% meskipun data hasil penelitian ini tidak dapat dilakukan uji statistik dengan ANOVA dan LSD karena data yang diperoleh adalah 0 dan TBUD.
Beberapa penelitian telah banyak dilakukan di Indonesia mengenai penggunaan bahan alami dalam bidang endodontik. Jika dibandingkan dengan bahan alami lainnya, efek antibakteri ekstrak daun Afrika menunjukkan perbedaan dengan ekstrak bahan alami lainnya terhadap bakteri Porphyromonas gingivalis. Penelitian yang dilakukan Vivi Leontara dan Nevi Yanti (2014) menunjukkan bahwa ekstrak lerak mempunyai efek antibakteri terhadap Porphyromonas gingivalis dengan nilai KBM pada konsentrasi 25%39 dan penelitian Sarah Amalia (2012) juga menunjukkan bahwa ekstrak pegagan memiliki daya antibakteri terhadap bakteri Porphyromonas gingivalis dengan nilai KBM sebesar 25%.40 Penelitian Sidabutar (2014) juga menemukan efek antibakteri ekstrak etanol kulit buah manggis terhadap
Porphyromonas gingivalis dengan nilai KBM diperoleh pada konsentrasi 0,0975%.49 Perbedaan efek antibakteri dari berbagai bahan alami dapat disebabkan oleh karena adanya perbedaan senyawa aktif pada masing-masing bahan alami tersebut.
Efek antibakteri yang dimiliki ekstrak daun Afrika dikarenakan adanya senyawa aktif yang terkandung di dalamnya yaitu flavonoid, antraquinones, tannis, saponins dan alkaloids. yang berperan dalam mengganggu fungsi membran atau dinding sel bakteri.43 Flavonoid merupakan kelompok senyawa fenol yang bersifat lipofilik dan membentuk senyawa kompleks dengan protein ekstraseluler dan protein yang terlarut sehingga dapat merusak dinding sel bakteri. Anthraquinones merupakan
senyawa fenol yang bekerja sebagai antibakteri mirip dengan sifat-sifat fenol lainnya, yaitu menghambat bakteri dengan cara mendenaturasi protein.43 Tannins pada konsentrasi tinggi bekerja sebagai anti mikroba dengan cara mengkoagulasi dan mengumpulkan protoplasma mikroba sehingga terbentuk ikatan yang stabil dengan protein dari bakteri tersebut.43 Saponins yang mempunyai sifat seperti sabun mempunyai mekanisme kerja dengan membentuk senyawa kompleks dengan membran sel bakteri melalui ikatan hidrogen yang kemudian dapat menghancurkan permeabilitas dinding sel bakteri yang mengakibatkan kematian sel. Alkaloids adalah senyawa nitrogen heterosiklik yang dapat melawan sel asing melalui ikatan dengan DNA sel sehingga mengganggu fungsi sel.43
Beberapa penelitian ekstrak daun Afrika juga telah dilakukan dengan mengujikannya pada bakteri lain. Beberapa diantaranya adalah penelitian yang dilakukan oleh Anibijuwon et al. (2012) menunjukkan ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) lebih efektif pada pertumbuhan bakteri gram positif yaitu bakteri Streptococcus mutans dengan nilai KHM 3% dan nilai KBM 5% dan pada bakteri Staphylococcus aureus dengan nilai KHM 4,5% dan KBM 12,3%.50 Pada penelitian Adetunji et al. (2013), ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) menunjukkan aktivitas antibakteri dengan nilai KHM pada bakteri gram positif dan gram negatif yaitu P. aueriginosa 2,5%, S. aureus 4,5% dan E.coli 3,5% sedangkan nilai KBM pada P. aueriginosa ditemukan 5%, S.aureus 12,5%, dan E.coli hanya menunjukkan bakteriostatik.51 Penelitian Tula et al. (2012) juga menemukan hasil aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Afrika dengan nilai KHM pada S.aureus
12,5%, S.typhi 17,5%, E.coli 15% dan P. aeruginosa 15%.52
Perbedaan hasil penelitian-penelitian tersebut kemungkinan terjadi karena adanya perbedaan kualitas ekstrak dan perbedaan jenis dan morfologi bakteri yang diujikan. Kualitas ekstrak yang digunakan dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu faktor biologis dan faktor kimia.53 Faktor biologis dari tumbuhan meliputi identitas jenis tumbuhan, perbedaan daerah dan keadaan geografis tanah, pemilihan daun yang digunakan, umur tumbuhan dan bagian tumbuhan yang digunakan.53 Perbedaan daerah dan keadaan geografis tanah yang berarti faktor eksternal dipengaruhi oleh lingkungan (tanah dan atmosfer), interaksi energi tumbuhan (cuaca,
temperatur, cahaya), dan materi (air, senyawa organik dan anorganik) memberi pengaruh pada kadar kandungan senyawa aktif yang terdapat dalam daun Afrika.53 Pada penelitian yang dilakukan Tula et al. (2012) menggunakan daun Afrika yang berasal dari Adamawa State, Nigeria.52 Pada penelitian yang dilakukan Anibijuwon et al. (2012) juga menggunakan daun Afrika yang berasal dari daerah yang berbeda yaitu Ilorin, Kwara State50, sedangkan peneliti menggunakan daun Afrika yang berasal dari Kel. Hamdan, Kec. Medan Polonia, Sumatera Utara, Indonesia.
Selain dipengaruhi oleh faktor biologis dari tumbuhan, kualitas ekstrak juga dipengaruhi oleh faktor kimia yang salah satunya adalah pelarut yang digunakan untuk maserasi simplisia daun Afrika yang berbeda.53 Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah menggunakan pelarut etanol 70% karena bersifat universal, relatif aman, dan tidak toksik. Penelitian Adetunji et al. (2013) menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun Afrika memiliki aktivitas yang lebih tinggi terhadap bakteri isolat dibandingkan dengan ekstrak air. Hal ini disebabkan oleh polaritas yang lebih tinggi dari etanol yang cenderung untuk lebih mengekstrak senyawa aktif daripada air.51 Hal ini juga sesuai dengan laporan dari Tula et al. (2012) yang menunjukkan efektivitas antibakteri ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) yang signifikan lebih tinggi daripada ekstrak metanol dan ekstrak air.52
Jenis bakteri yang berbeda juga menjadi salah satu kemungkinan faktor yang menyebabkan perbedaan hasil efek antibakteri ekstrak daun Afrika oleh karena adanya perbedaan morfologi dari setiap jenis bakteri. Morfologi bakteri yang berbeda terlihat dari perbedaan struktur dinding sel bakteri sehingga diduga menyebabkan perbedaan aktivitas dan besar konsentrasi bahan coba dalam menghambat dan membunuh sel bakteri tersebut. Bakteri gram positif dan bakteri gram negatif memiliki struktur internal yang sama, tetapi struktur eksternal yang berbeda.36,54 Struktur sel bakteri gram negatif mengandung membran eksternal yang kompleks yaitu terdiri dari struktur bilayer lipopolysaccharide, lipoprotein dan phospholipid. Bagian dalam membran eksternal dengan bagian luar membran internal sitoplasma diikat oleh periplasmicspace yang terdiri dari lapisan murein atau dapat juga disebut lapisan peptidoglycan.31,48 Bakteri yang diuji peneliti adalah bakteri Porphyromonas gingivalis. Bakteri Porphyromonas gingivalis adalah bakteri gram negatif obligat
anaerob dan berpigmen hitam yang tidak berspora.31 Bakteri gram negatif memiliki struktur dinding sel yang lebih kompleks bila dibandingkan dengan bakteri gram positif sehingga mekanisme kerja dan akses senyawa antibakteri daun Afrika lebih sulit terhadap membran sel dan menjadikan bakteri Porphyromonas gingivalis lebih resisten terhadap antibakteri (Gambar 23).
Penelitian ini membuktikan bahwa ekstrak daun Afrika memiliki efek antibakteri secara in vitro. Hal ini kemungkinan akan menunjukkan hasil yang berbeda jika diaplikasikan dalam saluran akar karena bakteri yang terdapat dalam infeksi saluran akar adalah bersifat infeksi polimikrobial dan bakteri Porphyromonas gingivalis merupakan salah satu bakteri saluran akar yang memiliki kemampuan untuk melekat dan membentuk suatu lapisan biofilm pada saluran akar. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian secara in vitro terhadap genotif dan fenotif bakteri
Porphyromonas gingivalis dan bakteri patogen lainnya yang dikultur langsung dari lesi endodontik primer dan secara in vivo sebagai lanjutan penelitian ini sehingga daun Afrika dapat digunakan sebagai bahan medikamen saluran akar secara klinis. Berdasarkan pembahasan diatas maka hipotesis penelitian ini yaitu ada efek antibakteri ekstrak daun Afrika terhadap Porphyromonas gingivalis diterima. Hal ini terbukti dengan diperolehnya nilai KBM yaitu pada konsentrasi 50% dengan nilai KHM yang tidak dapat diperoleh.
Gambar 23. Sistematik komposisi sel bakteri Porphyromonas gingivalis54
Adapun keterbatasan dari penelitian ini adalah sarana prasana penelitian yang sulit dijangkau karena menggunakan laboratorium di luar lingkungan Universitas Sumatera Utara. Selain itu, pada penelitian ini dalam menentukan nilai KHM alat ukur yang digunakan secara visual sehingga untuk penelitian selanjutnya dapat menggunakan spektrofotometer dan Polymer Chain Reaction. Pada penelitian ini juga dalam perhitungan jumlah koloni masih menggunakan metode Drop Plate Miles Misra yang hanya menunjukkan zona keruh pada tetesan sehingga menyulitkan untuk menghitung jumlah koloni bakteri sehingga selanjutnya dapat menggunakan metode
