Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Kimia Pangan PAU IPB, Laboratorium Mikrobiologi Pangan Departemen Ilmu dan Tekonologi Pangan IPB, serta Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Bioteknologi Pangan SEAFAST Center IPB, pada bulan Januari hingga September 2013.
Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan untuk mengekstraksi alkaloid dari daun pepaya, antara lain daun pepaya calina (IPB 9), sodium dodecylsulfate (SDS) (Merck & Co., New Jersey, USA), kertas saring Whatman no.1, akuades, H2SO4 (Merck & Co., New Jersey, USA) 2% (v/v), reagen Mayer (HgCl2, KI), Na2CO3 (Merck & Co., New Jersey, USA) 5% (b/v), kloroform (J.T. Baker, Pennsylvania, USA), fenolftalein, Na2SO4(Merck & Co., New Jersey, USA), dan gas N2.
Isolasi S. aureus dilakukan dari beberapa pangan, yaitu ayam suwir, sate jeroan, bakso, telur balado, tumis usus ayam, dan susu sapi mentah. Bahan dan media yang digunakan pada proses isolasi ini, yaitu NaCl 0.85%, baird-parker agar(BPA) (63 g/liter, Oxoid Ltd., Hampshire, UK), kuning telur, kalium telurit 1%, mannitol salt agar (MSA) (111 g/liter, Oxoid Ltd., Hampshire, UK), Staphylase test kit (Oxoid Ltd., Hampshire, UK), dan APIStaph (bioMérieux Inc., North Carolina, USA). Bahan yang digunakan pada penentuan nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) ialahtriptone soya agar (TSA) (40 g/liter; Oxoid Ltd., Hampshire, UK), triptone soya broth (TSB) (30 g/liter; Oxoid Ltd., Hampshire, UK), mueller hinton agar (MHA) (38 g/liter; Oxoid Ltd., Hampshire, UK), dimethyl sulfoxide(DMSO) (Merck & Co., New Jersey, USA). Selain itu bakteri S. aureusATCC 25923 juga digunakan sebagai pembanding.
Bahan-bahan yang digunakan untuk deteksi gen sea pada isolat S. aureus, antara lain bahan untuk isolasi DNA, yaitu bufer TE 1x (Tris 1M; 0.5M EDTA pH 8), lisozim (Bio Basic Canada Inc., Ontario, Kanada), larutan SDS 10%, proteinase K (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), NaCl, cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) (Merck & Co., New Jersey, USA), kloroform, PCI (25:24:1) (fenol (MP Biomedicals, LCC, Illkirch, Perancis); kloroform; isoamil alkohol (Applychem, Darmstadt, Jerman)), CI (24:1) (kloroform, isoamil alkohol), isopropanol (Merck & Co., New Jersey, USA), dan etanol (Merck & Co., New Jersey, USA) 70%; bahan untuk amplifikasi gen sea, yaitu Dreamtaq Green PCR master mix (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), DNA cetakan, primer SEA1 dan SEA2, serta air bebas nuklease; bahan untuk elektroforesis, yaitu loading dye (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), bufer TAE (tris asetat EDTA), agarosa (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), etidium bromida (EtBr) (Amersham BioSciences, Uppsala, Swedia), GeneRuler 100 bp DNA ladder plus (#SM0321, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), dan akuabides.
13 Bahan-bahan yang digunakan dalam menganalisis ekspresi gen sea, antara lain bahan untuk ekstraksi RNA, yaitu peqGOLD Bacterial RNA Kit (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Jerman) dan DNAse I, RNase free (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA); bahan untuk sintesis cDNA, yaitu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), primer SEA (SEA1 dan SEA2), primer 16S rRNA (16sF dan 16sR3); serta bahan untuk real-time PCR, yaitu KAPA SYBR® FAST qPCR Kit Master Mix (Kappa Biosystems, Massachusetts, USA).
Peralatan Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, pipet mikro 10 ml, pipet mikro 1 ml, pipet mikro 100 µl, pipet mikro 10 µl, blender, oven vakum (VWR A143 A-143, Sheldon Manufacturing, Inc., Oregon, USA), ultrasonic bath (Bransonic Ultrasonic Cleaner model 8510E MTH, Branson Ultrasonic Corporation, Connecticut, USA), rotari evaporator (Butchi Rotavapor R-210, BÜCHI Labortechnik, Flawil, Switzerland),stomacher (BagMixer®400P, Interscience, Perancis), sentrifuge (Hermle Z383K; Hermle Labortechnik GmbH, Wehingen, Saint Nom, Jerman), spektrofotometer UV-1800 (Shimadzu, Jepang), perangkat elektroforesis DNA (Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories Pte. Ltd, Singapore), Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, California, USA),gel doc (Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories Pte. Ltd, Singapore), Swift Spectrum Themal Cycler 48 (Esco Healthcare Pte. Ltd., Singapore).
Prosedur Penelitian
Tahapan di dalam prosedur penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 4. Di dalam tahap isolasi dan deteksi S. aureus penghasil SEA dari pangan, deteksi keberadaan genseahanya dilakukan pada 10 isolatS. aureusyang diperoleh dari sampel pangan. Dari isolat-isolatS. aureuspenghasil SEA yang diperoleh, hanya 1 isolat yang digunakan pada tahapan penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM), pemaparanS. aureusdengan ekstrak kasar alkaloid, serta pada pengukuran tingkat ekspresi gensea.
Persiapan Daun Pepaya
Daun pepaya berwarna hijau tua dan sehat (tidak terserang penyakit atau berlubang) dikumpulkan dari pohon pepaya calina (IPB 9) yang ditanam di University Farm, Institut Pertanian Bogor. Daun dicuci 2 - 3 kali dengan air kran mengalir. Daun dikeringkan dengan oven vakum pada suhu 55 °C selama 22 jam (Caro et al. 2000). Daun kering dihaluskan hingga membentuk bubuk dengan menggunakan blender, dilewatkan pada saringan berukuran 40 mesh, dan disimpan pada wadah tertutup. Kadar air daun pepaya basah dan kering diukur menggunakan metode oven (AOAC 2005) sebanyak 3 ulangan.
14
Ekstraksi alkaloid daun pepaya Persiapan daun pepaya
Isolasi dan deteksiS. aureuspenghasil SEA dari pangan
Gambar 4 Diagram alir tahapan penelitian. Ekstraksi Alkaloid Daun Pepaya
Daun pepaya kering sebanyak 10 g disuspensikan dalam 400 ml SDS 0.2 % dan disonikasi selama 2.5 jam di dalam ultrasonic bath pada suhu 25 - 35°C. Ekstrak dipisahkan dengan kain saring dan residu pada kain saring dicuci dengan 20 ml akuades. Selanjutnya, ekstrak disaring dengan kertas Whatman no. 1. Ke dalam filtrat ditambahkan larutan H2SO42% hingga diperoleh pH 3-4 dan alkaloid dipresipitasi dengan 15 ml reagen Mayer. Presipitat dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2 400 × g selama 10 menit dan dilarutkan dengan Na2CO35% lalu diekstraksi dengan CHCl3. Lapisan organik yang terbentuk dicuci dengan akuades hingga pH menjadi netral dan dilewatkan pada Na2SO4. Larutan dievaporasi dengan rotari evaporator dan dikeringkan dengan gas N2 untuk memperoleh alkaloid (Djilani et al. 2006). Ekstrak alkaloid dilarutkan di dalam DMSO sebelum digunakan dalam analisis.
IsolasiS. aureusdari Pangan
S. aureusdiisolasi dari beberapa jenis pangan, yaitu ayam suwir, sate jeroan, telor balado, tumis usus, susu sapi mentah, dan bakso. Isolat S. aureus diperoleh melalui beberapa tahapan, yaitu isolasi bakteri terduga dari sampel pangan, identifikasi isolat terduga S. aureus secara konvensional, dan identifikasi isolat terdugaS. aureussecara molekuler dengan menggunakan PCR. Identifikasi isolat secara molekuler terdiri atas isolasi DNA bakteri, amplifikasi gen penyandi 16S rRNA, dan sekuensing.
Isolasi Bakteri Isolasi bakteriS. aureusdilakukan dengan menggunakan metode BAM (Bennet dan Lancette 2001) dengan modifikasi. Sebanyak 25 g atau 25 ml sampel pangan dimasukkan ke dalam plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan garam fisiologis 0.85% sebagai pengencer. Sampel dihancurkan dengan
Penentuan KHM ekstrak kasar alkaloid daun pepaya
PemaparanS. aureusdengan ekstrak kasar alkaloid
15 menggunakan stomacher selama 2 menit. Selanjutnya, dibuat seri pengenceran sampel, yaitu 10-1, 10-2, dan 10-3. Dua puluh lima gram sampel yang telah dihancurkan di dalam 225 ml larutan pengencer merupakan pengenceran 10-1.
Sebanyak 1 ml sampel pengenceran 10-1 dipipet dan dibagi ke dalam 3 cawan media BPA, yang disuplementasi dengan 50 ml/L larutan kuning telur–1% kalium telurit (kuning telur: NaCl 0.85%: kalium telurit 1% = 2:2:1). Selanjutnya, sebanyak 0.1 ml sampel pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3 masing-masing disebar ke dalam 1 cawan media BPA. Sampel diinkubasi pada 37°C selama 18 - 24 jam. Koloni dengan ciri-ciri tipikal S. aureus (bulat, cembung, berdiameter 2-3 mm pada pertumbuhan yang tidak padat, berwarna hitam, dan dikelilingi dengan zona buram (opaque) atau bening diambil dengan ose tusuk dan digoreskan pada media MSA dan diinkubasi pada 37°C selama 18 -24 jam. Koloni yang dapat mengubah warna media MSA menjadi kuning selanjutnya digunakan pada uji koagulase. Uji koagulase dilakukan menggunakan Staphylase Test Kit. Isolat yang mampu menghasilkan koagulase akan membentuk aglutinasi saat dicampurkan dengan reagen.
Identifikasi Isolat Terduga S. aureus dengan Metode Konvensional Isolat dengan hasil koagulase positif selanjutnya diidentifikasi dengan uji biokimia menggunakan analytical profile index (API) Staph. Hasil API kemudian dibaca dengan menggunakanapiwebTMidentification sofware.
Isolasi DNA Isolasi DNA S. aureus menggunakan metode Masonet al. (2001), dengan modifikasi, yaitu penggunaan lysostaphin digantikan dengan lisozim 10 mg/ml serta tanpa pemakaian RNase. Isolat yang menunjukkan positif S. aureus pada API ditumbuhkan pada media TSB dan diinkubasi pada 37°C selama 18–24 jam. Sebanyak 2 ml kulturS. aureuspada media TSB disentrifugasi pada 21 000 × g selama 1 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi menggunakan 560 μ l bufer TE 1x. Selanjutnya, ditambahkan 100 μ l lisozim (10 mg/ml) kemudian dicampurkan hingga homogen dan diinkubasi pada 37°C selama 1 jam (tabung dibolak-balik setiap 15 menit). Sebanyak 30 μ l SDS 10% dan 10 μ l proteinase K (10 mg/ml) ditambahkan dan diinkubasi kembali pada 37°C selama 1 jam (tabung dibolak-balik setiap 15 menit).
Setelah itu, 100 μ l NaCl 5M dan 80μ l CTAB-NaCl (10% CTAB di dalam 0.7 M NaCl) yang telah dipanaskan pada 65°C ditambahkan kemudian diinkubasi selama 10 menit pada 65°C. Kloroform dengan volume yang sama dengan suspensi ditambahkan lalu divorteks dan disentrifugasi pada 21 000 × g selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru dan diekstraksi 2 kali dengan PCI (25:24:1) dan 1 kali dengan CI, dengan volume yang sama dengan suspensi.
Fase aqueous pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan dilakukan presipitasi DNA menggunakan isopropanol absolut dingin sebanyak 0.7 x volume supernatan. Campuran tersebut diinkubasi pada -20°C selama 1 jam dan disentrifugasi pada 21 000 × g selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% lalu disentrifugasi pada 21 000 × g selama 5 menit. Pelet DNA dikeringkan dan diresuspensi dengan 30 μ l akuabides. Hasil isolasi DNA divisualisasi pada gel agarosa 1.5% dengan elektroforesis pada tegangan 120 V selama 45 menit.
16
Kuantifikasi DNA Konsentrasi dan kemurnian isolat DNA ditentukan dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Isolat DNA diencerkan 1:1000 menggunakan bufer TE 1x dan diukur absorbansinya (A260dan A280). Konsentrasi DNA (ng/µl) dapat dihitung dengan rumus A260x 50 x faktor pengenceran (1 OD A260= 50 ng/µl dsDNA). Kemurnian DNA dapat ditentukan dengan mengukur rasio A260/A280. Kemurnian DNA yang baik memiliki nilai rasio antara 1.8 sampai 2.0 (Johnson & Tyler 1993).
Amplifikasi Gen Penyandi 16S rRNA Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan Thermal Cycler 2720. Isolat DNA diamplifikasi dengan primer 16sF dan 16sR3 (Tabel 5). Campuran reaksi PCR sebanyak 25 μ l terdiri atas 12.5 µl DreamTaq Green master mix, 1 µl setiap primer (10 µM), 2 µl DNA cetakan (1000 ng/µl), dan 8.5 µl air bebas nuklease. Siklus PCR yang digunakan, yaitu 1 siklus denaturasi selama 5 menit pada 95°C, 30 siklus amplifikasi (denaturasi 1 menit pada 95°C, annealing 1 menit pada 55°C, dan extension1 menit pada 72°C), dan terminasi selama 5 menit pada 72°C (Leeet al. 2007).
Produk hasil amplifikasi divisualisasikan pada gel agarosa 1.5% dengan elektroforesis pada tegangan 120 V selama 35 menit. Sebagai marker digunakan 100-bp plus DNAladder. Gen penyandi 16S rRNA menghasilkan pita berukuran 240 bp.
Tabel 5 Primer yang digunakan pada PCR dan qRT-PCR
Target Primer Sekuen nukleotida (5’-3’) Amplikon (bp) Pustaka
sea SEA1 TTGGAAACGGTTAAAACGAA 120 Lee
et al.2007
SEA2 GAACCTTCCCATCAAAAACA
16S rRNA 16sR316sF AAGGGTTGCGCTCGTTGCCCGCCTGGGGAGTACG 240 Leeet al.2007
Sekuensing Sekuensing dilakukan untuk mengetahui urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat S. aureus dari pangan. Sekuensing dilakukan dengan mengirimkan hasil PCR gen penyandi 16S rRNA ke 1st Base Pte Ltd, Singapura, melalui PT. Genetika Science Indonesia. Sekuen yang diperoleh dianalisis dengan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/).
Identifikasi gensea
Identifikasi isolat S. aureus penghasil SEA dilakukan secara molekuler dengan menggunakan teknik PCR. Amplifikasi genseadilakukan dengan metode yang sama dengan amplifikasi gen penyandi 16S rRNA. Primer yang digunakan adalah primer SEA1 dan SEA2 (Tabel 5). Gen sea ditunjukkan dengan pita berukuran 120 bp. Isolat S. aureus penghasil SEA diinokulasikan pada TSA miring sebagai stok.
Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum
Sebelum penentuan KHM, dilakukan proses penapisan menggunakan metode sumur untuk menentukan kisaran konsentrasi ekstrak kasar alkaloid daun pepaya. IsolatS. aureusberumur 18 - 24 jam pada media TSB disentrifugasi pada 9 500 × g selama 10 menit dan pelet bakteri disuspensikan pada garam fisiologis
17 0.85% hingga mencapai kekeruhan setara dengan kekeruhan standar 0.5 McFarland (1.5 × 108CFU/ml). Kekeruhan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm dengan nilai absorbansi 0.08. Nilai absorbansi tersebut setara dengan 0.5 standar McFarland (Andrews 2005; Oliveira dan de Lencastre 2011).
Suspensi bakteri diinokulasikan menggunakan cotton swab steril pada seluruh permukaan MHA. Setelah itu, sumur dibuat menggunakan pembolong agar steril berdiameter 4 mm. Sebanyak 20 µl ekstrak kasar alkaloid daun pepaya (10 mg/ml, 8 mg/ml, 6 mg/ml, 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml) dipipet ke dalam lubang pada media. Media didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang dan diinkubasi tanpa dibalik pada 37 ºC selama 18-24 jam (Ehsan et al. 2009; Subramanian dan Saratha 2010). Sebagai kontrol negatif digunakan DMSO.
Penentuan KHM dilakukan dengan metode pengenceran makro. Sebanyak 100 μ l suspensi S. aureus berumur 18-24 jam dengan konsentrasi 106 CFU/ml diinokulasikan ke dalam 1 ml media TSB yang mengandung ekstrak kasar alkaloid daun pepaya pada berbagai konsentrasi (kisaran konsentrasi berdasarkan hasil penapisan). Kultur bakteri kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 24 jam dan digoyang dengan kecepatan 150 rpm (Mazzolaet al.2009; Subramanian dan Saratha 2010). Selanjutnya, dibuat seri pengenceran dari kultur bakteri pada setiap konsentrasi ekstrak alkaloid dan disebar pada media TSA. Media tersebut diinkubasi pada 37°C selama 48 jam dan dilakukan penghitungan jumlah bakteri. KHM90 merupakan konsentrasi ekstrak kasar alkaloid daun pepaya terendah yang dapat menghambat 90% pertumbuhan bakteri dibandingkan dengan jumlah awal inokulum (Fazeli dan Salehi 2007).
PemaparanS. aureusdengan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya
Sebanyak 100 μ l suspensiS. aureuspenghasil SEA, dengan konsentrasi 108 CFU/ml, dipipet ke dalam 5 ml media TSB yang telah ditambahkan dengan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya dengan konsentrasi 0, 1, dan 2 KHM. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 2 jam dan digoyang dengan kecepatan 150 rpm. Jumlah sel bakteri, sebelum dan setelah diinkubasi selama 2 jam, ditentukan dengan menggunakan metode agar sebar pada TSA. Pengukuran Tingkat Ekspresi Gensea
Tingkat ekspresi gen sea dari bakteri S. aureus yang telah dipaparkan dengan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya dapat diketahui melalui beberapa tahapan, yaitu, isolasi mRNA bakteri, sintesis cDNA, serta pengukuran ekspresi genseamenggunakanreal-timePCR.
Isolasi mRNA RNA diisolasi menggunakan peqGOLD Bacterial RNA Kit dan dilakukan sesuai dengan petunjuk yang terdapat pada kit. Sebanyak 2 ml kultur bakteri yang telah dipaparkan dengan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya disentrifugasi pada 5 000 × g selama 5 menit. Pelet bakteri diresuspensi dengan 100 µl bufer TE dan 30 µl lisozim 10 mg/ml. Selanjutnya, 450 µl RNA lysis buffer T ditambahkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Sampel tersebut dicampurkan dengan pipet dan diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu ruang. Sampel kemudian dipindahkan ke dalamDNA removing columnyang
18
telah dipasangkan dengancollection tube(CT) dan disentrifugasi pada 10 000 × g selama 2 menit.
Etanol 70% 1x vol (sekitar 550 µl) ditambahkan ke dalam sampel pada CT dan dicampurkan dengan pipet. Sebanyak 650 µl sampel dipindahkan ke dalam PerfectBind RNA column yang telah dipasangkan dengan CT dan disentrifugasi pada 10 000 × g selama 1 menit. Residu sampel yang terdapat pada CT kembali dimasukkan ke dalam PerfectBind RNA column yang sama dan disentrifugasi 10 000 × g selama 1 menit.
PerfectBind RNA column tersebut kemudian dipasangkan dengan CT baru dan ditambahkan 500 µl RNA wash buffer I lalu disentrifugasi selama 1 menit pada 10 000 × g dan cairan yang terdapat pada CT dibuang. PerfectBind RNA column tersebut kembali dipasangkan pada CT yang sama dan sebanyak 650 µl RNA wash buffer II ditambahkan lalu disentrifugasi pada 10 000 × g selama 1 menit. Larutan pada CT dibuang dan tahap penambahan RNA wash buffer II kembali dilakukan.
PerfectBind RNA columndipasangkan dengan CT dan disentrifugasi selama 2 menit pada 10 000 × g untuk mengeringkan matriks kolom. Selanjutnya, PerfectBind RNA column tersebut dipasangkan dengan tabung 1.5 ml dan sebanyak 30 – 50 µl air bebas nuklease ditambahkan langsung pada matriks, diinkubasi 1 menit, dan disentrifugasi selama 1 menit pada 6 000 × g untuk mengelusi RNA. Kemurnian RNA ditentukan dengan mengukur rasio A260/A280 dengan spektofotometer UV.RNA yang diperoleh diberi perlakuan denganDNAse I, RNase freeuntuk mendegradasi DNA yang terdapat ekstrak RNA.
Sintesis cDNA Sintesis cDNA menggunakan RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit dengan primer spesifik untuk gensea dan gen penyandi 16S rRNA sebagai gen referensi (Tabel 5). Prosedur sintesis cDNA dilakukan sesuai dengan petunjuk yang terdapat padakit. Campuran reaksi terdiri atas 1 µg RNA total, 20 pmol setiap primer, dan air bebas nuklease hingga volume 12 µl. Campuran diinkubasi pada 65ºC selama 10 menit. Selanjutnya, ditambahkan 4 µl bufer reaksi 5x, 1 µl RiboLock RNase Inhibitor (20 u/µl), 2 µl dNTP 10 mM, dan RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/µl). Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 42ºC selama 60 menit. Reaksi dihentikan melalui pemanasan pada 70ºC selama 5 menit.
Real-time PCR (qPCR) Real-time PCR dilakukan menggunakan Swift Spectrum Themal Cycler 48. Campuran reaksi terdiri atas 1μ l cDNA(100 ng/µl) sebagai cetakan, 0.8 µl setiap primer (10 µM) (Tabel 5), 10 µl KAPA SYBR® FAST qPCR Kit Master Mix, dan air bebas nuklease hingga volume 20 µl. Kondisi PCR yang digunakan, yaitu pre-denaturasi selama 1 menit pada 95°C, 45 siklus amplifikasi (denaturasi 1 menit pada 95°C, annealing 1 menit pada 55°C, extention 1 menit pada 72°C), dan terminasi pada 72°C selama 5 menit. Pembacaan fluoresens dilakukan setelah setiap tahap extention dan dilanjutkan dengan analisis kurva pelelehan pada suhu 70 - 90°C dengan step temperature 0.5°C dan constant time 10 detik (Lee et al. 2007). Ekspresi gen sea dihitung relatif terhadap sampel kalibrator dan gen referensi (16S rRNA) dengan metode perbandingan CT(2 ) (Schmittgen dan Livak 2008).
19 Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengujian sebanyak 3 ulangan diolah secara statistik menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95% (taraf signifikansi 0.05). Jika hasil uji berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan. Software yang digunakan adalah IBM SPSS Statistics 16.0. Hasil dilaporkan sebagai nilai rata-rata ± standar deviasi (SD).
20