BAB III. METODE PENELITIAN
G. Cara kerja
1. Uji pendahuluan (Ditjen POM, 1995) a. Uji alkaloida
Reaksi pengendapan :
Timbang 500 mg serbuk simplisia, tambahkan 1 ml HCl 2 N dan 9 ml air, panaskan diatas tangas air selama 2 menit, dinginkan dan saring.
Pindahkan masing-masing 3 tetes filtrat pada dua kaca arloji. Tambahkan 2 tetes Mayer LP pada kaca arloji pertama dan 2 tetes Bouchardat LP pada kaca arloji kedua. Jika pada kedua percobaan tidak terjadi endapan, maka serbuk tidak mengandung alkaloida.
Jika dengan Mayer LP terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning yang larut dalam methanol P dan dengan Bouchardat LP terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam, maka ada kemungkinan terdapat alkaloida.
b. Uji glikosida
Masukkan 0,1 ml ekstrak methanol dalam tabung reaksi, uapkan di atas tangas air. Pada sisa tambahkan 2 ml air dan 5 tetes alfa naftol LP.
Tambahkan hati-hati 2 ml H2SO4 P, terbentuk cincin berwarna ungu (Reaksi Molish).
c. Uji tannin
Ekstrak kental direaksikan dengan larutan ferri klorida, bila terjadi warna biru tua/hitam kehijauan menunjukkan adanya senyawa tannin.
d. Saponin
Masukkan 0,5 g serbuk yang diperiksa ke dalam tabung reaksi tambahkan 10 ml air panas, dinginkan dan kemudian kocok kuat-kuat selama 10 detik (jika zat yang diperiksa berupa sediaan cair, encerkan 1 ml sediaan yang diperiksa dengan 10 ml air dan kocok kuat-kuat selama 10 detik) : terbentuk buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit, setinggi 1 cm sampai 10 cm.
2. Isolasi dan identifikasi Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus (Labkes, 2000)
Spesimen karies gigi diambil menggunakan swab steril dengan cara dimasukkan ke dalam karies gigi, kemudian dimasukkan ke media BHIB.
Spesimen diinokulasikan ke dalam media Blood Agar Plate dan diinkubasi pada suhu 35 - 37o C selama 24- 48 jam. Koloni tersangka dari Blood Agar Plate dilakukan pewarnaan Gram untuk menemukan bakteri gram positif kokus bentuk rantai (Streptococcus mutans) dan gram positif kokus berkelompok tidak teratur (Staphylococcus aureus).
Hasil bakteri gram positif kokus bentuk rantai dilanjutkan dengan uji biokimia untuk menemukan bakteri gram positif kokus katalase negatif.
Bakteri yang termasuk golongan katalase negatif diamati sesuai dengan tabel Connie Mohan dalam National Committee for Clinical Laboratory Standart (NCCLS) untuk menemukan bakteri yang positif Streptococcus
mutans. yaitu : hemolisis (α, γ hemolisis); katalase (-); oksidase (-);
sorbitol (+); mannitol (+); nutrient broth + NaCl 6,5% (tidak tumbuh); bile esculin (-).
Hasil bakteri gram positif kokus berkelompok tidak teratur dilanjutkan dengan uji biokimia untuk menemukan bakteri gram positif kokus katalase positif. Bakteri yang termasuk golongan katalase positif diamati sesuai dengan tabel Connie Mohan dalam National Committee for Clinical Laboratory Standart (NCCLS) untuk menemukan bakteri yang positif Staphylococcus aureus yaitu : katalase (+); oksidase (-); Staphylase (+); koagulase (+); D-Nase (+).
3. Pengolahan Daun Jambu Biji (Psidium guajava L.) (Ditjen POM, 1986)
Daun Jambu Biji (Psidium guajava L.) yang segar dicuci bersih kemudian dipotong kecil-kecil lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 40o-60o. Daun yang telah dikeringkan disebut simplisia kering.
4. Pembuatan ekstrak daun Jambu Biji (Psidium guajava L.) (Ditjen POM, 1986; Ditjen POM, 2000)
a. Seduhan
Simplisia kering ditimbang sebanyak 10 gram dan 30 gram, dimasukkan ke dalam gelas kimia lalu disiram dengan air mendidih hingga 100 ml lalu dibiarkan selama 5 – 10 menit lalu di serkai.
b. Infus
Ditimbang simplisia kering sebanyak 10 gram dan 30 gram, masing-masing dibasahi dengan air suling sebanyak 2 kali bobotnya kemudian dimasukkan ke dalam panci infus ditambahkan air suling sampai 100 ml, panci ditutup kemudian dipanaskan pada suhu 90oC selama 15 menit. Ekstrak cair didinginkan lalu diserkai dingin dengan menggunakan kain flanel.
c. Dekokta
Ditimbang simplisia kering sebanyak 10 gram dan 30 gram, masing-masing dibasahi dengan air suling sebanyak 2 kali bobotnya kemudian dimasukkan ke dalam panci ditambahkan air suling sampai 100 ml, panci ditutup kemudian dipanaskan pada suhu 90oC selama 15 menit.
Ekstrak cair didinginkan lalu diserkai dingin dengan menggunakan kain flanel.
d. Maserasi
Ditimbang simplisia kering sebanyak 10 gram dan 30 gram, masing-masing dimasukkan ke dalam bejana maserasi lalu ditambahkan 100 ml etanol 96% kemudian bejana ditutup. Disimpan bejana ditempat yang terlindung dari cahaya selama 5 hari sambil berulang-ulang diaduk.
Setelah 5 hari diserkai kemudian ampas diperas. Ekstrak yang diperoleh disimpan ditempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Ekstrak yang diperoleh kemudian
diuapkan hingga diperoleh ekstrak kering. Dilakukan hal yang sama dengan menggunakan pelarut etanol 50%.
5. Analisis densitometri dengan TLC Scanner
Lempeng KLT dipotong dengan ukuran 20 cm x 10 cm kemudian dilakukan free wash dan diaktifkan di dalam oven pada suhu 110 o selama 30 menit. Masing-masing ekstrak daun jambu biji ditimbang kemudian dilarutkan dengan etanol 96 % sehingga diperoleh konsentrasi 5 mg/ml dan disentrifuge, selanjutnya masing-masing ekstrak ditotol pada lempeng KLT sebanyak 10 µl. Lempeng KLT kemudian dielusi dengan menggunakan eluen kloroform : aseton : asam formiat (7 : 3 : 2). Lempeng KLT selanjutnya dianalisa dengan menggunakan TLC Scanner.
6. Uji aktifitas daun jambu biji (Psidium guajava L.) terhadap Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus penyebab
karies gigi (Labkes, 2000; Lay, B.W., 2002) a. Media dan reagen
Media yang digunakan adalah agar Mueller Hinton (dengan ketebalan agar 4 mm). Reagen yang digunakan adalah larutan standar NaCl fisiologis steril; larutan hipoklorit 2% dan standar kekeruhan Mc Farland 0,5.
b. Prosedur pemeriksaan Disc Diffusion
Inokulum disiapkan dengan menggunakan kapas lidi steril atau sengkelit. Diambil 3-5 koloni Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus hasil isolasi spesimen klinik dan disuspensikan ke dalam masing-masing tabung berisi larutan NaCl fisiologis steril 5 ml, kemudian kapas lidi bekas pakai dibuang dalam larutan hipoklorit 2 %. Hasil suspensi bakteri dibandingkan dengan standar kekeruhan Mc Farland 0,5.
Kapas lidi dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan diputar beberapa kali kemudian ditekan-tekan pada dinding tabung untuk membuang kelebihan inokulum. Kapas lidi yang mengandung inokulum dihapuskan secara merata pada permukaan agar Mueller Hinton, kemudian cawan petri ditutup dan dibiarkan selama 3-5 menit.
Cakram kertas (paper disc) yang telah direndam dalam masing-masing konsentrasi ekstrak Daun Jambu Biji (infuse, dekokta, perasan dan seduhan) selama ± 10 menit diletakkan pada permukaan agar Mueller Hinton dan sedikit ditekan agar melekat sempurna dan tidak bergeser.
Kemudian didiamkan selama 15 menit. Setelah itu diinkubasi pada suhu 35-37 0 C selama 16-20 jam dalam posisi cawan terbalik (Streptococcus mutans). Untuk Staphylococcus aureus suhu inkubasi tidak boleh lebih dari 35 0 C dan lama inkubasi adalah 24 jam.
Hasil diperoleh dengan mengukur zona hambatan yang terbentuk pada agar. Semakin lebar/diameter zona hambatan yang terbentuk semakin efektif sampel menghambat pertumbuhan mikroorganisme.