DAFTAR LAMPIRAN
B. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap yaitu tahap persiapan bahan baku dan penelitian utama. Tahap persiapan bahan baku bertujuan untuk memproduksi polimer PHA yang kemudian akan digunakan pada penelitian utama. Penelitian utama merupakan pembuatan bioplastik dengan PEG 400 sebagai pemlastis dan kloroform sebagai pelarut.
1. Tahap Persiapan Bahan Baku
Bahan baku utama yang diperlukan untuk penelitian ini adalah polimer PHA. Polimer ini diperoleh dengan cara melakukan kultivasi Ralstonia eutropha secara terumpan (fed-batch) dan menggunakan hidrolisat pati sagu sebagai sumber karbon. Bahan baku disiapkan melalui tiga tahapan proses, yaitu persiapan media, kultivasi Ralstonia eutropha secara fed-batch dan proses hilir PHA.
a. Persiapan Media
Persiapan media meliputi proses pembuatan hidrolisat pati sagu secara enzimatis serta persiapan kultur dan media kultivasi.
i. Pembuatan Hidrolisat Pati Sagu
Metode pembuatan hidrolisat pati sagu dilakukan berdasarkan hasil penelitian Akyuni (2004). Diagram alir pembuatan hidrolisat pati sagu dapat dilihat pada Lampiran 1. Sedangkan prosedur pengukuran total gula dari hidrolisat pati sagu (sirup glukosa) dapat dilihat pada Lampiran 2.
ii. Persiapan Kultur dan Media Kultivasi
Galur bakteri yang digunakan adalah Ralstonia eutropha IAM 12368 yang diperoleh dari IAM Culture Collection, Institute of Molecular and Celular Bioscience, The University of Tokyo. Kultur bakteri R. eutropha dipelihara dalam media cair nutrient broth yang disimpan pada suhu 4 0C dan disegarkan setiap 2 minggu sekali. Media kultivasi yang digunakan merupakan formulasi terbaik hasil penelitian Atifah (2006). Hidrolisat pati sagu digunakan sebagai
sumber karbon, (NH4)2HPO4 sebagai sumber nitrogen serta
(NH4)2HPO4 dan KH2PO4 sebagai sumber fosfat.
Larutan mikroelemen (dalam g/L HCl 1 N) terdiri dari 2,78 g FeSO4.7H2O, 1,98 g MnCl2.4H2O, 2,81 g CoSO4.7H20, 1,67 g
CaCl2.2H2O, 0,17 g CuCl2.2H2O, dan 0,29 g ZnSO4.7H2O. Setiap
media kultivasi ditepatkan pH-nya menjadi 7,0 dengan NaOH 4 M dan H3PO4 1,33 N. Komposisi media kultivasi dapat dilihat pada
Tabel 2. Hidrolisat pati sagu dan media garam mineral disterilisasi dalam otoklaf menggunakan wadah terpisah pada suhu 121 0C selama 15 menit. Selanjutnya media didinginkan sampai pada suhu ruang dan siap digunakan sebagai media propagasi maupun media kultivasi.
Tabel 2. Formulasi media kultivasi (Atifah, 2006)
Bahan Konsentrasi per liter media K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 0,1 M Mikroelemen Total gula (NH4)2HPO4 5,8 g 3,8 g 10 ml 1 ml 30 g 5,66 g
b. Produksi PHA Secara Fed-Batch (Atifah, 2006)
Kultivasi Ralstonia eutropha dengan sistem kultivasi terumpan (fed-batch) dilakukan pada bioreaktor volume kerja 10 liter. Pengumpanan hidrolisat pati sagu dilakukan berdasarkan Atifah (2006), yaitu pada saat mikroba diperkirakan memasuki fase pertumbuhan stasioner atau pada saat jam ke 48. Hidrolisat pati sagu yang diumpankan dengan volume tertentu setara dengan kadar total gula 20 g per liter media. Diagram alir proses kultivasi Ralstonia eutropha secara fed-batch dapat dilihat pada Lampiran 3.
Kultivasi dilakukan selama 96 jam dengan aerasi sebesar 0,2 vvm, agitasi 150 rpm, pH 6,5-7,5 dan suhu bioreaktor 37 0C. Pengecekan kondisi proses dilakukan setiap 12 jam dan bila timbul busa yang cukup banyak di dalam bioreaktor dapat ditambahkan larutan anti busa secukupnya. Pengendalian pH dilakukan secara otomatis, larutan alkali yang disiapkan adalah NaOH 4 M sedangkan larutan asamnya adalah H3PO4 1,33 N.
c. Proses Hilir PHA (Modifikasi dari Atifah 2006, Hahn et al. 1994, dan Ramsay et al. 1992)
Setelah proses kultivasi selesai (jam ke 96), cairan kultivasi disentrifugasi sebanyak empat tahapan. Setiap tahapan sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 13.000 rpm selama sepuluh menit pada suhu 4 0C. Kecepatan sentrifugasi 13.000 rpm ini setara dengan 27.504 G. Sentrifugasi tahap pertama bertujuan untuk mengendapkan biomassa dari cairan kultivasi. Endapan yang diperoleh kemudian dibilas dengan aquades untuk pembersihan, kemudian dilakukan sentrifugasi tahap kedua. Hasil bilasan ditambah NaOCl 0,2 %, kemudian dilakukan proses digest selama satu jam untuk menghancurkan materi sel selain PHA. Proses digest dilakukan di dalam labu erlenmeyer 250 ml yang ditempatkan pada water bath shaker dengan suhu 37 0C dan kecepatan putar 120 rpm.
PHA dapat dikeluarkan dari dalam sel dan terpisah dari materi sel setelah proses digest dengan NaOCl. Sentrifugasi tahap ketiga dilakukan untuk memisahkan hasil digest (PHA) dari cairannya (NaOCl dan materi sel terlarut). Hasil sentrifugasi tahap ketiga kemudian dibilas dengan metanol. Metanol berguna untuk melarutkan sisa NaOCl dan materi sel lain yang masih tersisa sehingga terpisah dari PHA. Pemisahan PHA dari metanol dilakukan dengan sentrifugasi tahap keempat. Endapan hasil sentrifugasi keempat diambil dan diletakkan diatas cawan petri, kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 50
0
dengan oven, namun PHA ini masih mengandung pengotor seperti protein, lemak, dan media kultivasi yang tersisa, sehingga perlu dimurnikan lebih lanjut. Diagram alir proses hilir PHA dapat dilihat pada Lampiran 4.
Polimer PHA yang telah dikeringkan dan ditumbuk sampai halus dilarutkan ke dalam kloroform dengan perbandingan 1:50 (b/v). Campuran tersebut kemudian direfluks pada suhu 50 0C dengan pengadukan menggunakan magnetic stirer selama 20-24 jam. Setelah selesai, campuran kemudian disaring dengan corong Buchner menggunakan kertas saring Whatman 42. Cairan yang lolos kertas saring kemudian ditampung di atas cawan petri dan pelarut diuapkan pada suhu ruang. PHA yang didapatkan dari proses ini sudah berbentuk lembaran seperti plastik dan siap digunakan pada penelitian utama.
2. Pembuatan Film Bioplastik (Juari, 2006)
Pada penelitian ini perlakuan yang diujikan adalah konsentrasi pemlastis PEG 400 yang digunakan. Pembuatan bioplastik dilakukan dengan 3 konsentrasi pemlastis PEG 400 yaitu 10%, 20%, dan 30% (b/b). Bioplastik terbaik ditentukan dengan melihat hasil analisa kuat tarik dan perpanjangan putusnya. Bioplastik terbaik kemudian dianalisa sifat thermal, derajat kristalinitas, dan analisa gugus fungsinya. Setiap taraf perlakukan pada penelitian ini dilakukan pengulangan sebanyak dua kali. Diagram alir proses pembuatan bioplastik yang dilakukan pada penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 5.
Proses pembuatan film bioplastik dilakukan dengan cara pencampuran antara PHA – pelarut kloroform – pemlastis PEG 400. Pencampuran dilakukan dengan melarutkan 0,27 g PHA dengan pelarut kloroform di dalam botol kecil (20 ml). Larutan PHA-kloroform diaduk selama 1 jam dengan menggunakan magnetic stirer pada suhu 50 0C dan menggunakan pendingin tegak. Setelah 1 jam, ke dalam larutan tersebut dimasukkan PEG 400 dengan konsentrasi tertentu sesuai yang akan diujikan. Larutan PHA-kloroform-PEG 400 diaduk kembali pada kondisi
yang sama selama 0,5 jam. Perbandingan antara PHA dengan PEG 400 dan kloroform yang digunakan adalah 1:35, dengan jumlah PEG 400 tergantung dari persentase pemlastis yang ingin diuji (Tabel 3). Contoh cara penghitungan formula bioplastik pada Tabel 3 dapat dilihat pada Lampiran 6. Setelah pengadukan selesai, larutan dituang ke dalam cetakan kaca (4,5 x 19 cm) dan dibiarkan dalam suhu ruang sampai kloroform menguap semua dan terbentuk lembaran plastik.
Tabel 3. Formula bioplastik
Kode PHA (g) Kloroform (g)
PEG 400