Desain, Waktu dan Tempat
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang dilaksanakan pada
bulan Maret-Agustus 2013. Pada tahap awal, dilakukan adaptasi Macaca
fascicularis sebagai hewan coba, kultivasi biomassa probiotik E. faecium IS-
27526 serta menyiapkan pakan selama pengujian. Pemeliharaan dan perlakuan serta pengukuran berat badan, profil lipid dan CRP monyet ekor panjang dilakukan di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) Lodaya Bogor. Aktivasi dan kultivasi probiotik dilakukan di laboratorium Mikrobiologi PAU IPB serta Fakultas Teknobiologi Universitas Atmajaya. Pembuatan pakan monyet dilaksanakan di PT. Carmelitha Lestari Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan antara lain yaitu kultur E. faecium IS-27526, bahan-
bahan kultivasi probiotik (MRSBroth, yeast extract, glukosa, KH2PO4, K2HPO4,
C2H3NaO2, (NH4)2HPO4, MgSO4, MnSO4, agar, Potato Dextrose Agar (PDA), VRBA, MRSA, susu skim) dan bahan pembuatan pakan (tepung daging, tepung kepala lele dan minyak ikan lele, tepung ubi jalar, isolat kedelai, butter, telur dan gula). Minyak ikan yang digunakan telah melalui proses pemurnian terlebih dahulu. Bahan yang digunakan untuk pengambilan darah dan analisis profil lipid adalah sampel plasma darah dan reagen test dari PT. Rajawali Nusindo.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah peralatan untuk kultivasi
biomassa probiotik dan analisis mikrobiologi meliputi; shaker-incubator,
fermentor, laminar flow, inkubator, autoklaf, mikropipet, bunsen, tabung reaksi,
timbangan, cawan petri, centrifuge. Untuk pembuatan pakan diperlukan hand-
blender, sendok, timbangan digital, panci. Pengukuran berat badan menggunakan
timbangan digital. Peralatan yang digunakan untuk pengambilan darah jarum suntik, tabung EDTA, alkohol dan plester. Alat untuk analisis profil lipid adalah pipet mikro, eppendorf, sentrifuge dan alat analisis darah.
Jumlah dan cara pengambilan sampel
Setiap perlakuan menggunakan 3 ekor monyet (unit percobaan), sehingga keseluruhan menggunakan 9 ekor monyet. Pengambilan sampel 9 ekor digunakan rumus Federer yaitu :
(T-1) (n-1) > 15 (3-1) (n-1) > 15 (3-1) (n-1) > 15 2n > 15+2 = 17 n = 9
Seharusnya jumlah sampel setiap kelompok adalah 9 ekor sehingga jumlah keseluruhan hewan coba 27 ekor. Akan tetapi yang dilakukan pada penelitian hanya sepertiga dari jumlah seharusnya yaitu 3 ekor tiap kelompok (9 ekor jumlah
keseluruhan) sehingga dikategorikan pilot study. Pengelompokan MEP dilakukan
secara acak sehingga rata-rata berat badan antar kelompok cenderung sama.
Alur Penelitian
Penelitian ini fokus pada penggunaan produk pakan fungsional dari tepung
dan minyak ikan lele dan probiotik pada monyet ekor panjang (Macaca
fascicularis). Hewan yang digunakan dalam penelitian ini 9 ekor monyet ekor
panjang betina usia tua (10-15 tahun, ditentukan berdasarkan dentisi) hasil penangkaran Pusat Studi Satwa Primata Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat-Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB) dengan bobot
badan berkisar antara 2–4 kg. Parameter yang diamati adalah perubahan BB,
profil lipid, dan CRP. Kadar lipid darah yang diukur meliputi kadar kolesterol
total, trigliserida, HDL dan LDL. Seluruh monyet ekor panjang (Macaca
fascicularis) yang digunakan bebas dari penyakit tuberkulosis dan simian
retrovirus (SRV). Seluruh perlakuan yang melibatkan hewan percobaan dilakukan
berdasarkan Ethical Clearance yang telah ditentukan dan disetujui Komisi
Kesejahteraan Hewan Laboratorium PSSP IPB (ACUC) dengan nomor P.01.13- IR. Alur penelitian disajikan pada Gambar 6. Tahap penelitian terdiri dari tiga bagian, yaitu masa persiapan bahan intervensi, masa adaptasi dan masa perlakuan.
Persiapan bahan
Persiapan bahan intervensi terbagi atas beberapa tahap antara lain: pembuatan biomassa probiotik E.faecium IS-27526, uji viabilitas probiotik, dan pembuatan pakan untuk hewan coba.
1. Persiapan stok probiotik
Probiotik yang digunakan pada penelitian adalah strain E. faecium IS-27526
yang diisolasi dari dadiah, susu fermentasi asal Sumatera Barat. Biomassa probiotik digunakan sebagai stok kultur yang akan dicampurkan pada pakan. Pembuatan stok probiotik dimulai dari tahap aktivasi dan kultivasi menggunakan medium MRS-Broth, fermentasi dalam fermentor 10 liter selama 22 jam pada suhu 370C pada kondisi anaerobik. Hasil kultivasi selanjutnya di sentrifus pada
suhu 40C selama 20 menit untuk memperoleh biomassa E. faecium IS-27526.
Biomassa kemudian dipindahkan ke falcon tube dan dibekukan dengan N2 cair
kemudian disimpan dalam freezer. Diagram alir pembuatan stok biomassa
probiotik disertakan pada Lampiran 1.
2. Uji Viabilitas Probiotik
Analisis mikrobiologi dilakukan untuk mengetahui viabilitas probiotik dan cemaran. Analisis viabilitas juga dilakukan setiap 2 minggu selama penelitian untuk mengetahui kelayakan jumlah bakteri probiotik yang dicampurkan pada pakan. Cara kerja uji mikrobiologi diuraikan pada Lampiran 2.
3. Pembuatan pakan untuk hewan coba
Pakan yang diberian pada penelitian ini adalah pakan aterogenik. Tujuan pemberian pakan aterogenik untuk memicu kondisi tidak normal pada profil lipid
dan CRP MEP sehingga dapat dilihat pengaruh minyak ikan dan probiotik dalam melakukan proteksi. Masing-masing perlakuan diberikan pakan aterogenik (tepung kuning telur) 0,1% (20 gram). Formula dasar yang digunakan adalah modifikasi formula biskuit yang diperkaya tepung ikan lele dan isolat protein formula terbaik hasil formulasi Kusharto et al. (2012). Berikut komposisi pakan ketiga jenis perlakuan (Tabel 7).
Tabel 7 Komposisi pakan formulasi
Jenis Bahan Jumlah bahan (gram)
Pakan A1 Pakan A2 Pakan A3
Gula 125 125 125
Telur 50 50 50
Tepung Kepala Ikan Lele - 7.5 7.5
Tepung Badan Ikan Lele 25 17.5 17.5
Tepung Kedelai 50 50 50
Tepung Terigu 75 75 75
Tepung Ubi Jalar 75 75 75
Butter (BOS) 150 150 75
Minyak Ikan Lele - - 75
Tepung kuning telur 20 20 20
Probiotik - 108 cfu/g 108 cfu/g
Ket: (-) tidak diberikan.
Pada komposisi pakan formulasi di atas terdapat perbedaan pakan A1, A2 dan A3 pada tepung kepala ikan lele, minyak ikan lele dan probiotik yang diberikan. Pada pakan A1 tidak diberikan penambahan tepung kepala ikan lele. Tepung kepala ikan lele mengandung mineral yang tinggi terutama kalsium, sehingga diharapkan dapat melihat efek pemberian tepung kepala terhadap kalsium darah MEP yang pada penelitian ini tidak diamati. Pada pakan A2 dilakukan penambahan probiotik, sedangkan pada pakan A3 dilakukan penambahan probiotik dan minyak ikan lele. Minyak ikan lele diberikan sebagai substitusi terhadap butter.
Masa adaptasi
Tahap persiapan pada penelitian utama adalah menyiapkan hewan coba. Hal yang pertama dilakukan adalah mengkarantina hewan selama 45 hari untuk memberikan waktu adaptasi. Hewan yang diujicobakan didatangkan dengan terlebih dahulu telah di ovariektomi. Tujuan ovariektomi adalah menghentikan fase bulanan pada MEP sehingga menjadi simulasi wanita lanjut usia (menopause) pada manusia. Hewan dikandangan dalam kandang individu yang ditempatkan pada posisi agar antar individu berinteraksi secara audiovisual. Minum diberikan
ad libitum dan makanan berupa pakan perlakuan diberikan 120 kal/kg bobot
badan/hari.
Kandang yang digunakan adalah kandang individu stainless steel (squeeze
back cage) untuk mempermudah dalam pemeliharaan dan pengendalian. Kandang
harus dibuat dengan konstruksi yang kuat untuk mencegah kerusakan disebabkan monyet itu sendiri. Jenis kandang perlu dilengkapi tempat peristirahatan yang agak tinggi dengan bentuk memadai memberi keleluasaan hewan coba untuk
bergerak (Sajuthi 1993). Kandang dengan ukuran 0,6 x 0,6 x 0,9 m dapat dilihat dalam Gambar 5.
Gambar 5 Kandang individu hewan coba
Peletakan kandang dibuat dalam bentuk satu sama lain individu masih dapat saling melihat dan mendengar. Menurut Smith dan Mangkoewidjojo (1988) hewan coba tidak boleh dikandangkan sendirian dan terpencil karena akan menimbulkan suatu bentuk cekaman yang mengganggu proses tingkah laku dan fisiologi normal. Setiap kandang dilengkapi dengan tempat pakan dan tempat air minum berupa mangkuk yang terbuat dari logam anti karat dan air minum
disediakan ad libitum, ditempatkan pada ruang tertutup dan bersih serta dilengkapi
dengan lampu, keran air, selang air, alat kebersihan dan house fan.
Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) betina usia tua pada saat
adaptasi kandang diberikan pakan komersial buatan Bangkok dengan merk
dagang monkey chow sebanyak 50-80 g/hari. Monkey chow berbentuk pakan
padat, kering dan agak keras dengan kandungan energi dan protein yang tinggi. Setelah adaptasi kandang selama 30 hari, dilakukan adaptasi pakan dimana pakan
monkey chow dikombinasikan dengan pakan intervensi.
Masa perlakuan
Pada masa perlakuan, ketiga kelompok hewan akan diberi pakan yang berbeda. Kelompok pertama diberikan pakan kontrol/standar. Pakan standar
merupakan pakan dengan komposisi formula terpilih dari penelitian Kusharto et
al. 2012). Kelompok ke dua akan diberikan pakan tepung lele dengan probiotik.
Kelompok ke tiga diberikan pakan tepung lele yang ditambah dengan minyak ikan lele dan probiotik.
A1 = pakan standar
A2 = pakan standar + probiotik
A3 = pakan standar + probiotik + minyak lele
Pakan diberikan dalam bentuk pelet sebanyak 100 gram/hari diberikan dua kali untuk pagi dan siang. Pertimbangan jumlah pakan yang diberikan sesuai kebutuhan energi monyet ekor panjang 120 Kalori/kg BB (Bennet et al. 1996). Pada masa perlakuan dilakukan penimbangan berat badan (BB), pengambilan darah untuk menganalisis profil lipid dan CRP MEP.
Metode Pengukuran Parameter
Hewan disedasi pada awal penelitian dan setiap 4 minggu dengan ketamin HCl 10% (10 mg/kg bobot badan) secara intramuskuler untuk tujuan penimbangan dan pengambilan sampel darah. Bobot badan ditimbang dengan timbangan digital. Darah diambil dari vena femoralis sebanyak 3 ml dalam tabung dengan antikoagulan EDTA. Alat yang digunakan adalah alat analisis darah merek
Nihon Kohden Celltax. Sampel darah digunakan untuk analisis kolesterol plasma
(mg/dL), trigliserida (mg/dL), kolesterol HDL (mg/dL), dan kolesterol LDL (mg/dL). Pengukuran total kolesterol plasma, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL menggunakan prinsip enzimatik kolorimetrik.
Pengukuran kadar kolesterol total
Pengukuran kadar kolesterol total dilakukan dengan uji kolorimetrik
enzimatis dengan metode CHOD-PAP menggunakan test kit yang dikeluarkan PT.
Rajawali Nusindo. Kolesterol ditentukan setelah proses hidrolisis dan oksidasi
secara enzimatis. Indikator quinoneimine terbentuk dari hasil reaksi antara
hidrogen peroksida dan 4-aminophenezone dengan adanya fenol dan perosidase. Prinsip reaksi:
Kolesterol ester + H20 kolesterol + asam lemak Kolesterol + O2 kolesterol-3-one + H202
2H2O2 + 4-aminophenazone + phenol quinoneimine + 4H20 dimana:
CHE = kolesterol esterase CHO = kolesterol oksidase Konten dan komposisi reagen:
R1 4x100 ml reagen enzim
Buffer fosfat (pH 6.5) 100 mmol/l
4-aminophenazone 0.25 mmol/l Fenol 5 mmol/l Peroksidase > 5 KU/l Kolesterolesterase > 150 U/I Kolesteroloksidase > 100 U/I Natrium Azide 0.05 % 2 3 ml Standar
Kolesterol 200 mg/dl atau 5.17 mmol/l Pengukuran
Panjang gelombang 500 nm, Hg 546 nm
Suhu 250C atau 370C
Prinsip Membandingkan sampel dengan blanko.
CHE CHO
Tabel 8 Skema pengukuran kadar kolesterol total
Pipetkan ke kuvet Blanko Sampel/Standar
Sampel/standar R1 - 1000 µl 10 µl 1000 µl
Campurkan, inkubasi selama 10 menit pada suhu 250C atau 5 menit pada suhu
370C. Lakukan pengukuran absorban sampel/standar bandingkan dengan blanko.
Hasil akan keluar secara otomatis dalam satuan mg/dl.
Pengukuran kadar kolesterol HDL
Pengukuran kadar kolesterol HDL menggunakan test kit kolesterol merek,
dari PT Rajawali Nusindo. Kilomikron, VLDL (very low density lipoprotein) dan
LDL (low density lipoprotein) diendapkan dengan penambahan asam
fosfotungstat dan magnesium klorida. Sesudah dilakukan sentrifugasi, cairan supernatan yang mengandung fraksi HDL digunakan untuk analisis kolesterol HDL dengan test kit kolesterol.
Konten, komposisi reagen:
R1 4x80 ml bahan endapan
Asam fosfotungstat 0.55 mmol/l Magnesium klorida 25.00 mmol/l
2 Standar kolesterol
Kolestero 50.00 mg/dl
atau 1.29 mmol/l
Persiapan reagen
1. Endapan untuk semi-mikro assays
Cairkan bahan pada R1 dengan 20 ml air destilata atau 4 botol R1 dengan 1 bagian air destilata (4+1).
Tabel 9 Skema pengukuran I kadar HDL Kolesterol
Pipetkan ke kuvet Makro Semi-mikro
Sampel R1 (Tanpa pencampuran) R1 (dengan pencampuran) 500 µl 1000 µl --- 200 µl --- 500 µl Campurkan, inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Sentrifus selama 2 menit pada 10000 g, atau 10 menit pada 4000 g.
Setelah dilakukan sentrifugasi pisahkan supernatan dari endapan dan lanjutkan untuk pengukuran dengan test kit kolesterol.
2. Penetapan kolesterol-HDL
Tabel 10 Skema pengukuran II kadar HDL Kolesterol
Pipetkan ke kuvet Blanko Standar Sampel
Air Destilata Standar Supernatan HDL 100 µl --- --- 1000 µl --- 100 µl --- 1000 µl --- --- 100 µl 1000 µl
Campurkan, inkubasi selama 5 menit pada suhu 370C atau 10 menit pada suhu
250C. Ukur absorbansi sampel dan standar bandingkan dengan blanko. Hasil
Pengukuran kadar trigliserida
Pengukuran kadar trigliserida dilakukan dengan uji kolorimetrik enzimatis dengan metode GPO-PAP menggunakan test kit dikeluarkan oleh PT Rajawali Nusindo. Trigliserida ditentukan setelah hidrolisis enzimatis dengan lipase. Indikator quinoneimine terbentuk dari hydrogen peroksida, 4-aminoantipyren dan 4-klorofenol dibawah pengaruh katalisis dari peroksidase.
Prinsip reaksi:
Trigliserida gliserol + asam lemak
Gliserol + ATP gliserol-3-fosfat + ADP Gliserol-3-fosfat O2 dihidroksiaseton-fosfat + H202
H2O2 + 4-aminoantypirene + 4-klorofenol quinoneimine + HCl + 2H20
Konten, komposisis reagen:
R1 4x100 reagen enzim
Larutan buffer :
Buffer pH 7.5 50 mmol/l
4-klorofenol 5 mmol/l
4-aminoantipirine 0.25 mmol/l
Ion magnesium 4.5 mmol/l
ATP 2 mmol/l
Lipase ≥ 1.3 U/ml
Peroksidase ≥ 0.5 U/ml
Gliserol Kinase ≥0.4 U/ml
Gliserol-3-fosfat oksidase 0.05 mmol/l
2 3 ml standar Trigliserida 200 mg/dl atau 2.28 mmol/l Pengukuran Panjang gelombang 500 nm, Hg 546 nm Suhu 250C atau 370C
Prinsip Bandingkan sampel dengan blanko.
Tabel 11 Skema pengukuran kadar Trigliserida
Pipetkan ke kuvet Blanko Sampel/Standar
Sampel/standar R1 - 1000 µl 10 µl 1000 µl
Campurkan, inkubasi selama 10 menit pada suhu 250C atau 5 menit pada suhu
370C. Lakukan pengukuran absorban sampel/standar bandingkan dengan blanko.
Hasil akan keluar secara otomatis dalam satuan mg/dl. Lipase
GK
GPO
Penetapan Kadar Kolesterol LDL
Kadar kolesterol LDL dihitung dari konsentrasi kolesterol total, kolesterol HDL dan Trigliserida dengan menggunakan persamaan berikut:
Kolesterol LDL= Total Kolesterol - HDL - Trigliserida mg/dl 5
Pengukuran CRP
Tujuan analisis CRP adalah untuk mengetahui adanya infeksi kerusakan jaringan atau inflamasi. CRP merupakan protein khusus yang disintesis hati sebagai respon terhadap peradangan yang terjadi pada pembuluh darah. Metode yang digunakan pada uji ini adalah metode kualitatif. Prinsip pengujian adalah aglutinasi pasif terbalik dimana latex dilapisi antibodi CRP dan yang dideteksi adalah antigen CRP dalam serum dengan kadar tinggi, aglutinasi terlihat dalam 2 menit.
Bahan : Serum
Reagen : Latex (suspense polysterin latex)
Cara kerja : Masukkan 50 mikro liter serum ke dalam test slide, tambahkan
satu tetes suspense, campurkan suspense dengan cara digoyang. Putar test slide selama dua menit lihat aglutinasi yang terjadi. Interpretasi hasil:
Hasil positif = aglutinasi kasar; positif lemah= aglutinasi halus; hasil negatif = tidak ada aglutinasi.
Gambar 6 Alur tahap penelitian
Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Faktorial (RAF) dengan 2 faktor yaitu faktor A (jenis pakan) dan faktor B (lama waktu intervensi).
Model matematika dari rancangan ini adalah:
Yijk = µ + Ai+ Bj + ABij + єijk
Keterangan:
Yijk : Pengamatan faktor A taraf ke-i, faktor B taraf ke-j dan ulangan ke-k
µ : Rataan umum
Ai : Pengaruh faktor A pada taraf ke-i
Bj : Pengaruh faktor B pada taraf ke-j
Abij : Interaksi antara Faktor A dengan Faktor B
Pembuatan stok
biomassa E. faecium
IS-27526
Pembuatan pakan lele ditambah minyak dan
probiotik Masa Adaptasi
Macaca fascicularis
selama 45 hari
Pemberian pakan
pada Macaca selama
90 hari
Penimbangan berat badan pada titik 0,30,60 dan 90 hari Pengambilan darah untuk mengukur: 1. Profil lipid 2. CRP Pada titik 0, 30, 60 dan 90 hari. Pengujian viabilitas dan kemurnian probiotik setiap minggu selama 90 hari.
Analisis Data
Analisis mikrobiologi probiotik, konsumsi dan CRP ditabulasi dan disajikan secara deskriptif, pengaruh perlakuan terhadap berat badan dan profil lipid monyet ekor panjang dianalisis dengan uji statistik menggunakan Analysis of Variance (ANOVA). Analisis statistik dilakukan pada masing-masing parameter pengamatan, yaitu total berat badan, kolesterol, LDL, trigliserida dan HDL monyet ekor panjang sesuai dengan titik pengamatan. Jika terdapat hubungan dan pengaruh yang nyata, maka akan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan.