3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli-Agustus 2021 di Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Rancangan Penelitian
Pemeriksaan SARS-CoV-2 dimulai dengan pengambilan sampel swab pada masyarakat yang dilakukan oleh Satuan Tugas Balai Teknik Lingkungan dan Pengendalian Penyakit (BTKLPP) Medan. Sampel diambil secara purposive sampling yang merupakan salah satu teknik pengambilan sampel berdasarkan dengan kriteria-kriteria tertentu (Sugiyono, 2008). Kriteria yang digunakan dalam penelitian ini adalah masyarakat yang melakukan swab dengan kategori swab pertama sebanyak 30 orang, diuji secara individual dengan metode RT-PCR untuk menentukan hasil negatif dan positif. Selanjutnya, sampel positif dan negatif diuji kembali berdasarkan tiga kategori viral load yaitu high (<20), intermediet (>20<30) dan low (>35) (Meletis, 2020) dengan metode pooled test dengan perbandingan 1:4, 1:6 dan 1:9 (Mulu, 2021). Dilakukan tiga kali pengulangan pada setiap perbandingan.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Sampel Individu
Pemeriksaan SARS-CoV-2 dilakukan secara swab (nasofaring dan orofaring) dengan kategori swab pertama. Sampel dimasukkan ke dalam cryotube yang berisi Viral Media Transport (VTM) sebanyak 30 sampel. Setiap spesimen diberi tanda sesuai dengan kode yang telah ditentukan dan disusun ke dalam rak sampel dan dilakukan pengujian ekstraksi RNA.
3.3.1.1 Ekstraksi RNA Individu
Ekstraksi RNA dilakukan sesuai metode Maccura Nucleic Acid Extraction Kit, Fast version (Maccura Biotechnology, 2020). Kit tersebut terdiri dari well extraction Kit, 320µl Mag-Bind RNA Extraction Kit, internal control, control positif
12
dan control negative. Penambahan internal control pada Mag-Bind RNA Extraction Kit sebanyak 64µl lalu di vortex dan dilakukan centrifuge spin down selama 15 detik.
Sediakan well Extraction Kit yang terdiri dari 12 well, dimana pada well 1 dan 7 berisi Magnetic nanoparticles; well 2 dan 8 berisi Lysis Buffer; well 3 dan 9 berisi Wash Buffer 1; well 4 dan 10 berisi Wash Buffer 2; well 6 dan 12 berisi Elution Buffer. Sebanyak 10µl Mag-Bind; 2µl Internal control; 200µl sampel; 200µl control negative dan control positif dimasukkan kedalam well 2 dan 8. Running well extraction kit selama 16 menit. RNA hasil ekstraksi tersebut diambil sebanyak 35µl dan dipindahkan kedalam collection tube. Selanjutnya RNA di amplifikasi.
3.3.1.2 Amplifikasi cDNA Individu
Amplifikasi cDNA dilakukan secara RT-PCR dengan Maccura SARS-CoV-2 Fluorescent PCR Kit (Maccura Biotechnology, 2020). Persiapan master-mix dihitung sesuai dengan jumlah sampel yang akan di amplifikasi yang dapat dilihat pada Tabel 3.1. Sebanyak 17µl qRT-PCR Reaction Mix; 3µl qRT-PCR Enzyme Mix; 10µl RNA;
10µl control negative dan control positif dimasukkan ke dalam plate PCR.
Homogenkan dengan mix-mate dengan kecepatan 3000 Rpm selama 15 detik. Plate PCR diletakkan ke dalam mesin RT-PCR dengan menekan tombol Run sesuai dengan tamplate yang sudah diatur. Program RT-PCR untuk mendeteksi SARS-CoV-2 dapat dilihat pada Tabel 3.2.
Tabel 3.1 Komposisi master-mix RT-PCR
Master Mix Reaktan Komponen Volume (µl)/sampel
qRT-PCR
Tabel 3.2 Program RT-PCR untuk mendeteksi SARS-CoV-2
No. Tahapan Suhu Waktu Siklus
13
3.3.1.3 Interpretasi Nilai Ct
Keterangan hasil amplifikasi cDNA diinterpretasikan berdasarkan nilai Ct yang mencakup tiga gen target yang diantaranya E-gene, ORF1ab, N-gene dan IC sebagai kontrol ekstraksi. Berikut interpretasi nilai Ct dalam mendiagnosa SARS-CoV-2 dapat dilihat pada Tabel 3.3 sebagai berikut.
Tabel 3.3 Interpretasi nilai Ct sampel individu
No. Gen Target 3.3.2 Sampel Pooled Test
Sampel individu yang telah dideteksi, didapatkan hasil pengujian berupa sampel negatif dan positif. Sampel diseleksi untuk diuji kembali dengan menggunakan metode pooled test dengan perbandingan 1:4 (1 sampel positif dan 4 negatif), 1:6 (1 sampel positif dan 6 sampel negatif) dan 1:9 (1 sampel positif dan 9 sampel negatif). Kategori Nilai Ct yang digunakan dapat dilihat berdasarkan tingkat viral load dimana high (<25), intermediet (>25<30) dan low (>30) (Meletis et al., 2021). Diambil 100µl sampel negatif dan positif yang akan digabungkan, kemudian dimasukkan ke dalam tube 2 ml dan di vortex hingga homogen. Selanjutnya, dilakukan pengujian ekstraksi RNA pooled test.
3.3.2.1 Ekstraksi RNA Pooled test
Ekstraksi RNA dilakukan sesuai metode Maccura Nucleic Acid Extraction Kit, Fast version (Maccura Biotechnology, 2020). Kit tersebut terdiri dari well extraction Kit, 320µl Mag-Bind RNA Extraction Kit, internal control, control positif dan control negative. Penambahan internal control pada Mag-Bind RNA Extraction Kit sebanyak 64µl lalu di vortex dan dilakukan centrifuge spin down selama 15 detik.
14
Sediakan well Extraction Kit yang terdiri dari 12 well, dimana pada well 1 dan 7 berisi Magnetic nanoparticles; well 2 dan 8 berisi Lysis Buffer; well 3 dan 9 berisi Wash Buffer 1; well 4 dan 10 berisi Wash Buffer 2; well 6 dan 12 berisi Elution Buffer. Sebanyak 12µl (10µl Mag-Bind + 2µl Internal control); 200µl sampel; 200µl control negative dan control positive dimasukkan kedalam well 2 dan 8. Running well extraction kit selama 16 menit. RNA hasil ekstraksi tersebut diambil sebanyak 35µl dan dipindahkan kedalam collection tube. Selanjutnya RNA di amplifikasi.
3.3.2.2 Amplifikasi cDNA Pooled test
Amplifikasi cDNA pooled test dilakukan secara RT-PCR dengan Maccura SARS-CoV-2 Fluorescent PCR Kit (Maccura Biotechnology, 2020). Persiapan master-mix dihitung sesuai dengan jumlah sampel yang akan di amplifikasi yang dapat dilihat pada Tabel 3.4. Sebanyak 17µl qRT-PCR Reaction Mix; 3µl qRT-PCR Enzyme Mix; 10µl RNA; 10µl control negative dan control positive dimasukkan ke dalam plate PCR. Homogenkan dengan mix-mate dengan kecepatan 3000 Rpm selama 15 detik. Plate PCR diletakkan ke dalam mesin RT-PCR dengan menekan tombol Run sesuai dengan tamplate yang sudah diatur. Program RT-PCR untuk mendeteksi SARS-CoV-2 dapat dilihat pada Tabel 3.5 berikut.
Tabel 3.4 Komposisi master-mix RT-PCR
Master Mix Reaktan Komponen Volume (µl)/sampel
qRT-PCR
Tabel 3.5 Program RT-PCR untuk mendeteksi SARS-CoV-2
No. Tahapan Suhu Waktu Siklus
15
3.3.2.3 Interpretasi Nilai Ct
Keterangan hasil amplifikasi cDNA diinterpretasikan berdasarkan nilai Ct yang mencakup tiga gen target yang diantaranya E-gene, ORF1ab, N-gene dan IC sebagai kontrol ekstraksi. Berikut interpretasi nilai Ct dalam mendiagnosa SARS-CoV-2 dapat dilihat pada Tabel 3.6 sebagai berikut.
Tabel 3.6 Interpretasi nilai Ct sampel pooled test
No. Gen Target
Adapun batas ambang siklus dalam amplifikasi (Cut-off) yang telah disesuaikan berdasarkan dengan Maccura SARS-CoV-2 Fluorescent PCR Kit (Maccura Biotechnology, 2020) yang dapat dilihat pada Tabel 3.7 berikut.
Tabel. 3.7 Batas cut off nilai Ct
No. Gen target Negatif Positif
Data hasil penelitian yang telah diperoleh, dianalisis secara statistik dengan menggunakan software SPSS versi 22.0 dengan menggunakan uji Chi-square.
Interpretasi nilai signifikansi p<0,05 maka terdapat perubahan yang signifikan dan jika nilai p>0,05 maka hasil tidak signifikan.
16
BAB 4