3. METODOLOGI
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri atas empat tahap yaitu: tahap pengamatan proses pembongkaran ikan tuna di transit dan pengolahan produk tuna loin beku,
tahap penilaian sanitasi higiene tempat pembongkaran ikan (transit) dan penilaian
kelayakan dasar Unit Pengolahan Ikan (UPI), tahap penilaian risiko (risk assessment) kadar histamin, dan tahap sintesis hasil pengkajian efektivitas
penilaian risiko (risk assessment) kadar histamin sebagai kesimpulan dari penilaian risiko (risk assessment) kadar histamin pada proses pembongkaran ikan tuna di transit dan pengolahan produk tuna loin beku di unit pengolahan ikan tuna.
3.3.1. Tahap pengamatan proses pembongkaran ikan tuna di transit dan pengolahan produk tuna loin beku
Proses pembongkaran ikan tuna yang dilakukan di transit 14 (PT Mulia Sejahtera Mandiri) diamati berdasarkan tahapan prosesnya serta
diamati faktor sanitasi dan higiene dalam proses pembongkaran ikan tuna
di transit 14. Proses pengolahan tuna loin beku yang dilakukan di PT Makmur Jaya Sejahtera juga diamati berdasarkan tahapan prosesnya,
kemudian setiap tahapan proses tersebut dituangkan dalam bentuk prosedur pengolahan yang baik (Good Manufacturing Practices atau GMP). Model prosedur pengolahan yang baik (GMP) dapat dilihat pada Lampiran 7. Selain itu, faktor-faktor sanitasi dan higiene yang dapat mempengaruhi proses pengolahan tuna loin beku di PT Makmur Jaya Sejahtera dituangkan dalam bentuk prosedur pelaksanaan standar sanitasi (Sanitation Standard Operating Procedures atau
SSOP). Model prosedur pelaksanaan standar sanitasi (SSOP) dapat dilihat
pada Lampiran 8. Selanjutnya tahapan proses pengolahan tuna loin beku di PT Makmur Jaya Sejahtera digambarkan dalam bentuk diagram alir (flow chart). Model bentuk diagram alir proses pengolahan tuna loin beku dapat dilihat pada Lampiran 9.
Penilaian efektivitas dan efisiensi proses pembongkaran ikan tuna di transit 14 (PT Mulia Sejahtera Mandiri) dan proses pengolahan tuna loin beku
di PT Makmur Jaya Sejahtera dilakukan menggunakan parameter suhu dan waktu. Pengukuran suhu ikan tuna dilakukan menggunakan termometer digital yang ditusukkan tepat pada titik pusat ikan, sehingga dapat diketahui suhu ikan tuna. Prosedur pengukuran suhu dilakukan pada tahap-tahap sebagai berikut:
pembongkaran ikan tuna di transit, penerimaaan bahan baku ikan tuna di PT Makmur Jaya Sejahtera, pembentukan loin (loining), penimbangan
(weighing) I, penyuntikan gas CO (CO injection), pengikisan (trimming) II, dan pembekuan (freezing). Sedangkan pengukuran waktu proses dilakukan menggunakan stopwatch atau alat pengukur waktu yang lain.
Prosedur pengukuran waktu dilakukan pada tahap-tahap sebagai berikut:
pembongkaran ikan tuna di kapal hingga pengangkutan ke transit 14, waktu tunggu di transit 14 sebelum pengangkutan ke PT Makmur Jaya Sejahtera,
transportasi ke PT Makmur Jaya Sejahtera, pencucian (washing), pembentukan loin, pembuangan kulit (skinning) hingga penimbangan (weighing) I, penyuntikan gas CO (CO injection), pemotongan menjadi loin, steak, saku, cube (cutting to loin, steak, saku, cube) hingga pengikisan II (trimming II), serta pada tahap pembekuan (freezing). Pengukuran suhu ikan tuna dan waktu proses pengolahan ikan tuna di perusahaan dilakukan pada ikan tuna yang sama. Laporan hasil pengukuran suhu dan waktu dapat dilihat pada Lampiran 22. Pengukuran suhu dan waktu ini bertujuan untuk menentukan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi peningkatan kadar histamin serta menentukan tahap-tahap yang memiliki peluang terjadinya peningkatan jumlah bakteri pembentuk histamin.
3.3.2. Tahap penilaian sanitasi higiene tempat pembongkaran ikan (transit) dan penilaian kelayakan dasar Unit Pengolahan Ikan (UPI)
Penilaian sanitasi higiene tempat pembongkaran ikan (transit) dan penilaian kelayakan dasar Unit Pengolahan Ikan (UPI) dilakukan menggunakan daftar penilaian yang mengacu pada Peraturan Direktur Jenderal Pengolahan dan Pemasaran Hasil Perikanan Nomor: PER.011/DJ-P2HP/2007 tentang Pedoman Teknis Penerapan Sistem Jaminan Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan. Dasar hukum penilaian kelayakan dasar perusahaan adalah Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan RI Nomor: PER.01/MEN/2007 tentang Pengendalian Sistem Jaminan Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan dan Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI Nomor: KEP.01/MEN/2007 tentang Persyaratan Jaminan Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan pada Proses Produksi, Pengolahan, dan Distribusi. Daftar penilaian sanitasi higiene tempat pembongkaran ikan (transit) dan penilaian kelayakan dasar Unit Pengolahan Ikan (UPI) dapat dilihat pada Lampiran 3 dan 4.
Penilaian sanitasi higiene dan kelayakan dasar digunakan untuk melihat kesesuaian antara bangunan, fasilitas, dan pekerja di transit dan Unit Pengolahan Ikan (UPI), serta proses pembongkaran ikan di transit dan proses produksi di Unit Pengolahan Ikan (UPI) kemudian dibandingkan dengan persyaratan yang telah ditetapkan oleh Departemen Kelautan dan Perikanan (DKP). Dalam penelitian ini, penilaian sanitasi higiene tempat pembongkaran ikan (transit) dan penilaian kelayakan dasar Unit Pengolahan Ikan (UPI) bertujuan untuk mengetahui hubungan antara kondisi sanitasi dan higiene serta proses pengolahan yang baik (GMP) di transit dan di Unit Pengolahan ikan (UPI) dengan peluang kontaminasi serta peningkatan kadar histamin. Selain itu, hasil penilaian kelayakan dasar juga dapat digunakan untuk mengetahui kelayakan proses pembongkaran ikan tuna dan proses pengolahan produk tuna loin beku, mengetahui kondisi sanitasi dan higiene, melakukan perbandingan dengan ketentuan dan peraturan yang ditetapkan, serta mengetahui tahapan kritis dalam proses pembongkaran ikan tuna dan dalam proses pengolahan produk tuna loin beku yang dapat mempengaruhi peningkatan kadar histamin dan jumlah bakteri.
32
3.3.3 Tahap penilaian risiko (risk assessment) kadar histamin
Penilaian risiko (risk assessment) kadar histamin dalam penelitian ini menggunakan konsep semi-quantitative risk assessment sesuai dengan metode yang dipaparkan oleh Sumner et al. (2004). Dalam aplikasinya, risk assessment terdiri atas empat komponen, yaitu: hazard identification (identifikasi bahaya), exposure assessment (penilaian paparan), hazard characterization (karakterisasi bahaya), dan risk characterization (karakterisasi risiko). Diagram alir hubungan empat komponen dalam risk assessment diperlihatkan pada Gambar 7.
Gambar 7. Diagram alir hubungan empat komponen dalam risk assessment (Sumner et al. 2004)
3.3.3.1Hazard identification (identifikasi bahaya)
Hazard identification merupakan proses pencarian atau identifikasi bahaya histamin dalam hubungannya sebagai penyebab keracunan pada manusia. Pada penelitian ini, hazard identification dilakukan terhadap bahaya peningkatan kadar histamin selama proses pembongkaran ikan tuna dan pengolahan tuna loin beku. Dasar penetapan masalah histamin ini adalah adanya isu global
mengenai peningkatan kadar histamin selama proses penanganan ikan tuna dan selama proses pengolahan tuna loin beku. Hazard identification meliputi identifikasi faktor-faktor yang mempengaruhi pembentukan histamin, peningkatan jumlah bakteri pembentuk histamin serta risiko histamin terhadap tubuh manusia. Identifikasi bahaya dilakukan dengan studi pustaka dari berbagai sumber literatur yang berkaitan dengan histamin dan bahayanya bagi tubuh serta faktor-faktor
Hazard Identification (Identifikasi Bahaya) Hazard Characterization (Karakterisasi Bahaya) Exposure Assessment (Penilaian Paparan) Risk Characterization (Karaktersasi Risiko)
yang mempengaruhi pembentukan histamin pada ikan tuna seperti faktor suhu dan lamanya waktu untuk melakukan proses penanganan dan pengolahan.
3.3.3.2 Exposure assessment (penilaian paparan)
Exposure assessment merupakan informasi mengenai level dari bahaya histamin pada tahap penanganan ikan tuna pasca penangkapan, tahapan
pengolahan produk tuna loin beku, serta frekuensi dan durasi dari konsumsi produk tersebut. Exposure assessment bertujuan untuk mengevaluasi
level kadar histamin pada ikan tuna dari berbagai kualitas mutu selama proses pembongkaran di transit dan mengetahui level peningkatan kadar histamin selama proses pengolahan tuna loin beku di perusahaan. Exposure assessment yang akurat memerlukan tiga tipe informasi yaitu: (1.) adanya bakteri pembentuk histamin dalam bahan baku, (2.) efek dari proses penangkapan, penanganan, pengolahan, distribusi, dan preparasi terhadap patogen, (3.) pola konsumsi, misalnya ukuran porsi yang dikonsumsi, disamping memerlukan frekuensi dan besarnya kontaminasi.
Informasi mengenai level kadar histamin, TVB, TPC, dan jumlah bakteri pembentuk histamin diperoleh dengan cara melakukan pengambilan sampel daging ikan tuna dari berbagai kualitas mutu yaitu mutu A, B, C, dan D pada
proses pembongkaran di transit 14 dan pada proses pengolahan produk tuna loin beku di PT Makmur Jaya Sejahtera, yaitu pada tahap pembentukan loin
dan pada produk akhir tuna loin beku. Sampel daging ikan tuna tersebut selanjutnya di analisis di Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan DKI Jakarta (BPMPHPK DKI Jakarta).
Analisis laboratorium yang dilakukan meliputi analisis kadar histamin, kadar Total Volatile Base (TVB), Total Plate Count (TPC), dan jumlah bakteri pembentuk histamin. Sampel daging ikan tuna pada proses pembongkaran di transit diambil dari hasil kumpulan checker perusahaan yang melakukan checker di bagian belakang sirip dada dan di bagian ekor ikan tuna. Sampel daging ikan tuna tersebut dipisahkan berdasarkan grade ikan tuna, yang meliputi grade A, B, C, dan D. Tabel data mentah dan hasil analisis kadar histamin, TVB, TPC, dan jumlah bakteri pembentuk histamin pada sampel ikan tuna dapat dilihat pada Lampiran 23 dan 24.
Rancangan yang digunakan untuk mengetahui perkembangan kadar histamin, TVB, dan TPC selama proses pembongkaran ikan tuna di transit 14 dan proses pengolahan tuna loin beku di PT Makmur Jaya Sejahtera
adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Pada proses pembongkaran ikan tuna di transit 14, perlakuan yang digunakan adalah perbedaan grade ikan tuna, yaitu tuna grade A, B, C, dan D. Sedangkan pada proses pengolahan tuna loin beku di PT Makmur Jaya Sejahtera, perlakuan yang digunakan adalah tahapan proses pengolahan yaitu tahap pembentukan loin dan produk akhir tuna loin beku. Data pada penelitian ini diambil sebanyak 3 kali ulangan dan ulangan yang digunakan adalah minggu pengambilan sampel. Hasil analisis statistik data kadar histamin, TVB, TPC, dan jumlah bakteri pembentuk histamin pada sampel ikan tuna dapat dilihat pada Lampiran 27.
Data hasil pengujian histamin ikan tuna yang dilakukan di Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan Kelautan DKI Jakarta (BPMPHPK DKI Jakarta) dari bulan September 2008 sampai dengan bulan Februari 2009 serta Frekuensi dan tingkat konsumsi ikan tuna di negara tujuan ekspor yaitu Amerika Serikat dan Jepang digunakan sebagai data sekunder dalam penelitian. Data tersebut diperoleh dari studi literatur mengenai data jumlah penduduk Amerika Serikat (U.S. Cencus Bureau 2009) dan data jumlah penduduk Jepang (Statistics Bureau 2009) serta dibandingkan dengan tingkat konsumsi ikan di Amerika Serikat (NOAA 2007) dan tingkat konsumsi ikan di Jepang (FAO 2008). Keadaan masyarakat atau populasi penduduk yang mengkonsumsi makanan tersebut dapat diketahui dari studi literatur mengenai kejadian-kejadian keracunan histamin di negara tersebut, untuk memperkirakan kondisi
masyarakatnya. Berbagai sumber literatur tersebut antara lain: Food and Drug Administration (FDA), Food and Agriculture Organization
(FAO), National Offshore Aquaculture Act (NOAA), dan sumber-sumber penelitian mengenai histamin yang selalu di-update.
3.3.3.3 Hazard characterization (karakterisasi bahaya)
Hazard characterization merupakan usaha untuk menentukan peluang dan tingkat keparahan dari dosis histamin yang dikonsumsi oleh manusia. Komponen
dose-response. Penentuan tingkat keparahan tersebut dapat dilihat dari kadar histamin dan jumlah konsumsi produk yang dibandingkan dengan dose-response-nya. Dose-response merupakan batas dosis yang dapat menyebabkan keracunan histamin di dalam tubuh manusia yang mengkonsumsi produk yang mengandung kadar histamin tinggi. Hazard characterization dan dose-response dapat dilihat dari studi literatur mengenai bahaya histamin pada tubuh manusia yang mengkonsumsi produk yang mengandung kadar histamin tinggi dan dibandingkan dengan kadar histamin yang diperoleh dari hasil analisis. Dalam penelitian ini digunakan dose-response kadar histamin di negara tujuan ekspor yaitu Jepang dan Amerika Serikat.
3.3.3.4 Risk characterization (karakterisasi risiko)
Risk characterization merupakan perkiraan secara semi kuantitatif untuk menentukan risiko peningkatan kadar histamin berdasarkan hazard identification,
hazard characterization, dan exposure assessment. Hasil keluaran dari risk characterization ini adalah risk estimate atau perkiraan risiko. Risk estimate
merupakan suatu usaha untuk memperkirakan kategori risiko yaitu low (rendah), medium (sedang) atau high (tinggi) dari bahaya peningkatan kadar histamin pada produk tuna loin beku. Proses penentuan kategori risiko dilakukan menggunakan risk assessment spreadsheet yang mengacu pada Ross dan Sumner (2002).
Proses penentuan rangking risiko menggunakan risk assessment spreadsheet dilakukan dengan cara menjawab sebelas pertanyaan yang telah ditentukan dan mengubahnya menjadi data kuantitatif untuk selanjutnya dilakukan perhitungan. Sebelas pertanyaan tersebut adalah sebagai berikut:
a. Tingkat keparahan dari bahaya histamin
b. Persentase populasi yang dapat terkena efek dari bahaya histamin c. Frekuensi konsumsi produk tuna yang mengandung histamin
d. Proporsi dari populasi suatu negara yang mengkonsumsi produk tuna yang mengandung histamin
e. Jumlah populasi penduduk suatu negara f. Proporsi kadar histamin dari sampel
g. Efek proses pengolahan terhadap bahaya histamin h. Keefektifan sistem kontrol setelah proses pengolahan
i. Level kadar histamin yang dapat menyebabkan intoksikasi pada konsumen j. Efek preparasi sebelum konsumsi dalam mereduksi bahaya histamin
Setelah menjawab sebelas pertanyaan diatas maka akan diperoleh nilai ranking risiko (risk ranking) yang dapat digunakan untuk mengetahui kategori bahaya peningkatan kadar histamin pada produk tuna loin beku di Jepang dan Amerika Serikat. Perhitungan rangking risiko tersebut dilakukan dengan bantuan software “risk ranger” dari microsoft excel 2007. Model formulasi perhitungan risiko (risk assessment spreadsheet) untuk negara tujuan ekspor Jepang dan Amerika serkat dapat dilihat pada Lampiran 28 dan 29 serta dapat didownload di http://www.agsci.utas.edu.au.
3.3.4 Tahap sintesis hasil pengkajian penilaian risiko (risk assessment) kadar histamin
Hasil analisis kadar histamin terhadap sampel ikan tuna dibandingkan dengan standar yang berlaku di negara tujuan ekspor yaitu Jepang untuk ikan tuna segar dan Amerika Serikat untuk produk tuna loin beku. Selanjutnya dilakukan analisis keefektifan GMP atau SSOP dalam mereduksi terjadinya peningkatan kadar histamin. Probability (peluang) bahaya histamin, yaitu low atau rendah (risk ranking < 32), medium atau sedang (risk ranking 32-48), high atau tinggi (risk ranking > 48) diketahui dari hasil penentuan kategori risiko (risk ranking) menggunakan risk assessment spreadsheet. Berdasarkan hasil tersebut, maka dapat diketahui severity (tingkat keparahan) dari bahaya histamin yaitu automatic, may-likely (M/L), atau not-likely (N/L). Selanjutnya, rangkuman hasil pengkajian penilaian risiko (risk assessment) kadar histamin tersebut dituangkan dalam bentuk tabel.
3.4 Prosedur Pengujian Sampel
Prosedur kerja dari analisis kadar histamin, kadar Total Volatile Base (TVB), Total Plate Count (TPC), dan analisis jumlah bakteri pembentuk histamin yang dilakukan di Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan DKI Jakarta (BPMPHPK DKI Jakarta) dijelaskan seperti berikut:
3.4.1 Analisis kadar histamin (SNI 01-2360-1991)
Prinsip penentuan kadar histamin adalah zat histamin dalam contoh dikonversikan ke dalam bentuk -OH, kemudian diisolasi dengan resin penukar ion dan diubah ke bentuk derivatnya dengan ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT) dan diukur secara fluorometris. Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam ekivalen histamin levels. Prosedur kerja analisis kadar histamin terdiri atas tiga tahap yaitu sebagai berikut:
a. Tahap ekstraksi
Sepuluh gram sampel ditimbang lalu ditambahkan dengan methanol sebanyak 50 ml kemudian dihomogenkan dengan menggunakan homogenizer (blender) kurang lebih selama 1-2 menit. Setelah homogen maka sampel tersebut dipanaskan dalam water bath pada suhu 60 oC selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Selanjutnya setelah dingin, sampel tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan methanol sampai tanda tera lalu dikocok agar homogen. Setelah itu, larutan sampel disaring menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer.
b. Tahap clean up atau tahap elusi
Pertama-tama disiapkan kolom kromatografi (panjang 20 cm dan diameter 7 mm) kemudian ke dalam kolom tersebut dimasukkan glass wool secukupnya (tingginya 1 cm). Selanjutnya masukkan resin penukar ion (dowex 1-x800-100-mesh) ke dalam kolom sampai tingginya kurang lebih 8 cm (diusahakan resin tidak sampai kering dengan cara dibilas dengan aquades karena akan mempengaruhi daya kerja penukar ion tersebut). Selanjutnya sampel dilewatkan ke dalam kolom sebanyak 1 ml dan ditampung hasilnya dalam labu ukur 50 ml yang telah diberi 5 ml HCl 1 N.
c. Tahap pembentukan
Ke dalam masing-masing tabung reaksi dipipet sebanyak 10 ml HCl 0,1 N kemudian ditambahkan 5 ml sampel (hasil elusi), 5 ml standar histamin (sebagai larutan standar), dan 5 ml HCl 0,1 N (sebagai blanko). Setelah itu, ditambahkan 3 ml NaOH 1 N lalu dihomogenkan dan dibiarkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan lagi ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT) 1% sebanyak 1 ml lalu dihomogenkan dan didiamkan selama 4 menit. Selanjutnya ditambahkan
3 ml H3PO4 3,57 N lalu dihomogenkan. Setelah selesai, sampel siap untuk dibaca menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksitasi 350 nm dan panjang gelombang emisi 444 nm. Rumus perhitungan kadar histamin (ppm) adalah sebagai berikut:
Histamin (ppm) = Keterangan: IU = Absorban sampel A = Intercept B = Slope Fp = Faktor pengencer
3.4.2 Analisis kadar Total Volatile Base (TVB) (SNI 01-4495-1998)
Analisis ini bertujuan untuk menentukan jumlah kandungan senyawa- senyawa basa volatil yang terbentuk akibat degradasi protein. Prinsip dari analisis TVB adalah senyawa-senyawa basa volatil (amonia, mono-, di-, trimethylamine, dan lain-lain) yang terdapat dalam ekstrak daging ikan yang bersifat basa diuapkan pada suhu 35 oC selama 2 jam atau pada suhu kamar selama semalam. Senyawa-senyawa tersebut kemudian diikat oleh asam borat kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N.
Prosedur kerja analisis kadar TVB adalah sebagai berikut: pertama-tama sampel ditimbang sebanyak 25 gram, lalu ditambahkan 75 ml larutan TCA 7% dan diblender selama 1 menit sampai homogen, lalu disaring
menggunakan kertas saring sehingga diperoleh filtrat yang jernih. Selanjutnya 1 ml asam borat dipipet dan dimasukkan ke dalam cekungan tengah (inner chamber) cawan conway. Menggunakan pipet ukuran 1 ml yang lain, filtrat
sampel dimasukkan ke dalam cekungan luar (outer chamber) pinggir kiri dari cawan conway. Tutup cawan conway pada posisi hampir menutup, kemudian tambahkan 1 ml larutan K2CO3jenuh ke dalam cekungan luar (outher chamber) pinggir kanan. Setelah itu cawan ditutup rapat dengan mengoleskan vaseline pada tutup cawan, selanjutnya cawan sedikit digoyang selama 1 menit untuk mencampur sampel dan K2CO3 pada outer chamber cawan conway. Disamping itu, blanko dikerjakan dengan prosedur yang sama tetapi filtrat sampel diganti
dengan larutan TCA 5%. Tahap selanjutnya, cawan diinkubasi pada suhu 35 oC selama 2 jam. Setelah selesai inkubasi, bagian inner chamber cawan conway yang berisi asam borat 2% ditetesi dengan indikator conway sebanyak 2 tetes menggunakan pipet tetes lalu dititrasi menggunakan larutan HCl 0,02 N sehingga warna larutan asam borat 2% berubah menjadi warna merah muda yang sama dengan blanko. Rumus perhitungan kadar TVB adalah sebagai berikut:
Kadar TVB (mgN/100g) =
3.4.3 Analisis Total Plate Count (TPC) (SNI 01-2332.3-2006)
Prinsip kerja analisis TPC adalah pertumbuhan mikroorganisme setelah contoh diinkubasi dalam media agar pada suhu 35 oC selama 48 jam, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung.
Prosedur kerja analisis TPC adalah sebagai berikut: sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 25 gram dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered, kemudian dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Dengan menggunakan pipet steril, diambil 1 ml homogenat dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered sehingga diperoleh contoh dengan pengenceran 10-2. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Kemudian dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-3, 10-4, 10-5, dan seterusnya sesuai kondisi sampel. Selanjutnya untuk metode cawan agar tuang (pour plate method), dipipet sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Kedalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel, ditambahkan 12-15 ml media Plate Count Agar (PCA) yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45 oC. Setelah agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 oC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni bakteri yang ada di dalam cawan petri menggunakan
alat penghitung koloni. Jumlah koloni bakteri yang dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 25-250 koloni.
3.4.4 Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin (modifikasi Niven et al. 1981)
Prinsip dari analisis bakteri pembentuk histamin adalah enterobactericeae akan mengubah histidin menjadi histamin melalui proses dekarboksilase yang akan menaikkan pH dan merubah warna pada media.
Prosedur kerja analisis bakteri pembentuk histamin adalah sebagai berikut: media modifikasi niven agar dipersiapkan dengan cara mencampurkan
semua bahan, yaitu 0,1% trypton, 0,3% yeast extract, 1,8% L-histidin monohydrochlorid monohydrat, 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 2,5% agar,
dan 0,003% phenol red, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu diencerkan menggunakan aquades hingga 1000 ml. Selanjutnya dipanaskan hingga mendidih dan diatur pH 6,4 kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.
Sampel sebanyak 25 gram dimasukkan ke dalam botol yang berisi 225 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered, kemudian diblender hingga larutan homogen. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Dari campuran
tersebut diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered sehingga diperoleh contoh dengan
pengenceran 10-2, kemudian dikocok sampai homogen. Pengenceran dilakukan hingga 10-4. Satu ml larutan sampel hasil setiap pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri, lalu 12-15 ml media niven agar cair yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45 oC dituangkan kedalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel. Setelah agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 oC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni berwarna merah muda dengan halo pink pada latar belakang berwarna kuning atau orange. Koloni tersebut merupakan koloni bakteri pembentuk histamin. Hasil penghitungan jumlah koloni bakteri pembentuk histamin tersebut kemudian dibandingkan dengan nilai TPC
sehingga diperoleh persentase jumlah bakteri pembentuk histamin terhadap nilai TPC.
3.5 Analisis Data
Dalam penelitian ini, data hasil analisis kadar histamin, TVB, TPC, dan jumlah bakteri pembentuk histamin yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan program microsoft excel 2007 dan SAS. Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap faktor tunggal yaitu pada proses pembongkaran ikan tuna di transit, faktor yang digunakan adalah perbedaan grade ikan tuna, yaitu grade A, B, C, dan D, sedangkan pada proses pengolahan tuna loin beku di perusahaan, faktor yang digunakan adalah tahapan proses pengolahan tuna loin beku, yaitu tahap pembentukan loin dan produk akhir tuna loin beku. Ulangan yang digunakan