Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan dari Februari sampai dengan Juli 2010 di Laboratorium Protozologi dan Laboratorium Helmintologi Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah hewan coba berupa mencit strain Swiss Albino, P. berghei, pewarnaan Giemsa, infusa sambiloto dengan beberapa pengenceran (1x10-2, 1x10-4, 1x10-6), metanol, pakan mencit (pellet ikan), xylol, kertas saring, tissue minyak emersi, posphate buffer saline
(PBS), larutan Hayem, NaCl fisiologis.
Alat yang digunakan adalah syringe 1 ml, syringe 10 ml, mikroskop cahaya, objek gelas, gelas ukur, timbangan listrik, cawan penguap, mortar, stempher, mikrohematokrit, pipet kapiler eritrosit, sonde lambung, kandang mencitdan lemari pendingin.
Cara Kerja
Preparasi Hewan Coba
Penelitian ini menggunakan mencit strain Swiss Albino jantan dan betina sebanyak 30 ekor yang memiliki berat 25 g berumur 1.5-2.5 bulan. Hewan tersebut diperoleh dari kandang mencit Taman Syifa. Mencit dipelihara dalam kandang yang cukup untuk 3-5 mencit.
Kandang Hewan Coba
Pada penelitian ini mencit yang digunakan ditempatkan di dalam kotak kandang yang terbuat dari polipropilen atau polikarbonat dan diberi alas kandang secukupnya. Kandang tersebut diberi penutup kawat untuk tempat makan dan botol minum (Malole dan Pramono 1989). Dalam satu kandang dipelihara mencit sebanyak 3-5 ekor.
Pakan dan Minum
Pakan yang diberikan untuk mencit berbentuk pellet secara tanpa batasan (ad libitum). Air minum diberikan dengan menggunakan botol melalui pipa gelas atau pipa logam (Smith dan Mangkoewidjojo 1998). Tingkat konsumsi makanan dan air minum bervariasi menurut temperatur kandang, kelembaban, kualitas makanan, kesehatan dan kadar air dalam makanan (Malole dan Pramono 1989).
Pengambilan Darah Pada Mencit
Darah diperoleh dari medial canthus sinus orbitalis dengan menggunakan mikrohematokrit atau tabung kapiler. Darah tersebut digunakan untuk stok
P. berghei.
Penyimpanan dan Pembuatan Stok Plasmodium berghei
Stok P. berghei diperoleh dari Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia yang sudah diinfeksi selama lima hari pada mencit dan kemudian disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -700C (Jekti et al. 1996). Stok P. berghei dimasukan ke dalam mikrotube yang diberi heparin kemudian ditambahkan gliserol dengan tujuan agar darah tidak lisis dan rusak.
Pembuatan Infusa Sambiloto
Infusa sambiloto diperoleh dengan mengeringkan daun sambiloto kemudian direbus dalam air dengan perbandingan (25:100) sampai mendidih (900C) selama 10-15 menit (Wintarsih et al 2009) setelah itu disaring. Kadar sambiloto dalam infusa diukur dalam rotarioevaporator dan didapat kandungan sambiloto dalam cairan yaitu 0.98 g/ml.
Pengenceran yang digunakan yaitu 1x10-2, 1x10-4 dan 1x10-6. Pengenceran didapat dengan cara 1 ml infusa ditambah dengan 99 ml akuades kemudian dilakukan pengocokkan manual dengan menggunakan tangan sebanyak 170 kali dalam semenit dengan tujuan memperkecil partikel-partikel ekstrak sehingga mempercepat dan mempermudah perjalanan obat dalam tubuh mencit.
Infeksi P. berghei
P. berghei diinfeksikan pada mencit yang memiliki berat 25 g berumur 1.5-2.5 bulan secara intraperitoneal dengan dosis sebanyak 0.25 x 106 mm3/ ml per ekor. Dosis parasit ditentukan mula-mula dengan menghitung presentasi parasit dari ulasan darah yang diwarnai Giemsa kemudian dihitung jumlah parasit per jumlah eritrosit (Dewi et al 1996). Tahap selanjutnya yaitu perhitungan jumlah eritrosit dengan cara darah diencerkan dengan menggunakan larutan Hayem dalam pipet kapiler eritrosit kemudian dilakukan perhitungan eritrosit menggunakan Improved Neubauer Counting Chamber. Jumlah eritrosit didapat dengan membandingkan jumlah eritrosit dengan volume counted (0.02) lalu dikalikan dengan pengencer (200) per µl. Jumlah dosis parasit diperoleh dengan mengkalikan presentasi parasit dengan jumlah eritrosit yang telah dihitung dan dikonversikan menjadi per ml.
Kelompok Perlakuan
Penelitian ini menggunakan rancang acak lengkap (RAL) dengan tiga pengulangan. Dalam penelitian ini terdiri atas lima kelompok perlakuan yaitu kontrol normal (tanpa infeksi dan tanpa diobati), kontrol negatif (diinfeksi tanpa diobati), SB1 (infusa daun sambiloto dengan pengenceran 1x10-2), SB2 ( infusa daun sambiloto dengan pengenceran 1x10-4), SB3 (infusa daun sambiloto dengan pengenceran 1x10-6). Masing-masing kelompok perlakuan terdiri atas 3 ekor mencit jantan dan 3 ekor mencit betina.
Pemberian Infusa Sambiloto pada Mencit
Infusa sambiloto diberikan satu kali sehari setelah mencit diinfeksi secara peroral dengan menggunakan sonde lambung selama 4 hari setelah infeksi berturut-turut. Dosis pemberian sebanyak 0.5 ml/hari dengan kandungan sambiloto setiap pengenceran adalah 4.9 mg/0.5 ml, 0.049 mg/0.5 ml dan 0.00049 mg/0.5 ml.
Preparasi Ulas Darah
Pembuatan ulas darah dilakukan dengan cara pengambilan darah dari ekor mencit kemudian diteteskan pada gelas obyek pertama dengan posisi mendatar. Gelas obyek lain ditempatkan pada bagian darah tadi dengan posisi membentuk
sudut 45o sehingga darah menyebar sepanjang garis kontak antar kedua gelas obyek. Selanjutnya gelas obyek didorong ke arah depan dengan cepat hingga terbentuk usapan darah tipis di atas gelas obyek. Ulas darah tersebut dikeringkan di udara kemudian difiksasi dengan mengunakan metanol selama 5 menit lalu dimasukkan ke dalam pewarnaan Giemsa selama 30 menit dengan perbandingan 1 bagian giemsa dan 1 bagian PBS (Phosphate Buffer Saline). Selanjutnya dicuci dengan air mengalir pada posisi miring dan dikeringkan di udara.
Pengamatan Preparat Ulas Darah Perhitungan Diferensial Leukosit
Setiap kelompok perlakuan kemudian diamati diferensial leukosit di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak emersi dengan pembesaran 1000x. Setiap 100 leukosit yang ditemukan dihitung dan dikelompokkan ke dalam masing-masing jenis leukosit, yaitu neutrofil, monosit, limfosit, eosinofil dan basofil. Perhitungan leukosit menggunakan beberapa lapang pandang sepanjang ulasan yang digeser kearah tengah kemudian bergeser sejajar dengan tepi ulasan dan bergerak ke tepi kembali dan seterusnya sampai mencapai jumlah leukosit sebanyak 100. Nilai relatif leukosit yang ditemukan dinyatakan dalam satuan persen.
Pengolahan Data
Pengolahan data dilakukan dengan uji Analysis of Varian (ANOVA)-SPS- 17- System kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test untuk mengetahui perbedaan perlakuan yang diberikan (Mattjik dan Sumertajaya 1999).
0 10 20 30 40 50 0 2 4 6 8 9 10 11 Hari P e r s e n t a s e KNO KN SB1 SB2 SB3
