3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April sampai Nopember 2010 di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara dan Pusat Pembibitan Udang (hatchery) Serdang Bedagai, Sumatera Utara. Penyiapan preparat untuk Scanning Microscopy Electron (SEM) dilakukan di Laboratorium Bidang Zoologi Puslit Biologi, LIPI Cibinong.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, botol winkler, gelas ukur, pipet serologi, karet penghisap, spatula,
hockey stick, autoklaf, bunsen, oven, mikroskop cahaya, jangka sorong, aerator,
blower, pH meter, refraktometer, global positioning system, mortal, wadah plastik, dan scanning electron microscopy (SEM, JSM-5310LV).
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sampel air, tanah, dan udang dari tambak udang disekitar Kab. Serdang Bedagai. Media Nutrien Agar (NA), Mueller Hilton Agar (MHA), Thiosulfate-Citrat-Bile-Sucrose-Agar
(TCBSA), larutan fisiologis, akuades, alkohol 70%, reagen untuk pewarnaan Gram, media-media uji Biokimia (TSIA, TCA, SIM, glukosa, H2O2
- Lokasi 1 : Tambak Aktif pada N: 03
3%, gelatin), aluminium foil, kapas, cakram berisi antibiotik, larutan standar McFarland, dan kertas saring.
Sampel air, udang, dan tanah untuk isolasi bakteri resisten diambil dari 4 lokasi tambak udang di Kab. Serdang Bedagai, yaitu :
○ 34.301’ E: 099○07.137’- N: 03○34.265’ E: 099○07.115’, ketinggian 14 mdpl (50 m dari tepi Pantai Sialang Buah).
- Lokasi 2 : Tambak Nonaktif N : 03○34.264’ E : 099○07.200’- N : 03○34.293’ E : 099○
- Lokasi 3 : Tambak Aktif Dinas Perikanan dan Kelautan Sialang Buah N: 03
07.161’, ketinggian 14 mdpl (100 m dari tepi Pantai Sialang Buah). ○33.924’ E: 099○06.893’- N: 03○33.917’ E: 099○
- Lokasi 4 : Tambak non aktif N: 03
06.887’, ketinggian 14 mdpl (1000 m dari tepi Pantai Sialang Buah).
○33.528, E: 099○06.826 - N: 03○33.534, E: 099○
Larva udang windu stadium post larva diperoleh dari hatchery di lokasi Desa Sentang, Teluk Mengkudu, Serdang Bedagai, Sumatera Utara. Isolat murni Vibrio sp. diperoleh dari tambak PT. Budi, Serdang Bedagai dengan menggunakan media TCBSA.
06.832, ketinggian 6 mdpl (3000 m dari tepi Pantai Sialang Buah).
3.3 Isolasi Bakteri dari Sampel Air, Udang dan Tanah
Sampel untuk isolasi bakteri berasal dari air, udang, dan tanah/lumpur tambak dikumpulkan dari 4 tambak berbeda. Air tambak yang diambil sebanyak 100 ml, sampel udang sebanyak 5 ekor dengan berat rata-rata 10-15 g/ekor dan tanah diambil secukupnya dari 5 titik yang berbeda dalam tambak (tiap-tiap sudut dan tengah).
Sampel air sebanyak 0,1 ml disebarkan pada media NA yang dilarutkan dengan menggunakan air tambak kemudian diinkubasi selama 24-72 jam pada suhu 30±2○
Sampel udang dari masing-masing tambak yang masih aktif diproses secara terpisah dan aseptik. Sampel udang digerus kemudian diambil sebanyak 1 g dan dilarutkan dalam 10 ml air tambak steril. Larutan udang (aliqout) diambil sebanyak 0,1 ml kemudian dikultur dalam media NA dan diinkubasi selama 24-72 jam pada C. Masing-masing koloni dengan sifat fisik yang berbeda dipisahkan dan dikultur kembali dalam media NA untuk digunakan selanjutnya.
suhu 30±2○C. Masing-masing koloni dengan sifat fisik yang berbeda di kultur kembali pada media NA untuk digunakan selanjutnya.
Sampel tanah sebanyak 1 g dihomogenisasi dalam 10 ml air tambak steril. Sampel yang telah homogen diencerkan hingga 10-4. Sebanyak 0.1 ml sampel yang diencerkan disebarkan pada media NA kemudian diinkubasi selama 24-72 jam pada suhu 30±2○
3.4 Uji Sensitivitas Bakteri Terhadap Antibiotik
C. Masing-masing koloni yang berbeda dipisahkan dan dipurifikasi pada media NA berikutnya (Tendencia et al. 2001). Alur kerja isolasi bakteri resisten antibiotik dari tambak udang dapat dilihat pada Lampiran 1 (hlm 34).
Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik menggunakan metode difusi agar. Isolat uji disesuaikan kepadatan populasinya dengan menggunakan standar McFarland 108 cfu/ml. Alur kerja pembuatan standar McFarland dapat dilihat pada lampiran 2 (hlm 35). Media yang digunakan untuk pengujian adalah MHA yang dilarutkan dengan air tambak. Suspensi bakteri yang telah standar kemudian diinokulasi pada media MHA menggunakan cotton swab. Setelah ± 10 menit cakram yang berisi antibiotik (ukuran diameter disk 6 mm) diletakkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi dengan bakteri yang akan diuji.
Cakram antibiotik yang digunakan antara lain; 25 μg amoksisilin, 25 μg sulfametoksazol/trimetropim, 30 μg kloramfenikol, dan 15 μg eritromisin. Selanjutnya kultur diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 30±2○C. Setelah diinkubasi zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong (Tendencia et al.
2001). Alur kerja uji sensitivitas isolat bakteri terhadap antibiotik dapat dilihat pada Lampiran 3 (hlm 36).
3.5 Karakterisasi Bakteri Resisten Antibiotik
Isolat bakteri resisten terhadap antibiotik dikultur pada media NA kemudian kultur yang berumur ± 24 jam diidentifikasi menggunakan uji biokimia secara sederhana. Uji biokimia yang dilakukan antara lain pewarnaan Gram, uji sitrat, uji katalase, uji motilitas, uji gelatin, dan uji TSIA.
3.6 Isolasi Bakteri Vibrio sp.
Vibrio sp.diisolasi dari sampel air tambak udang PT. Budi, Serdang Bedagai. Media yang digunakan adalah TCBSA. Inkubasi dilakukan pada suhu 30±2○
3.7 Uji Patogenitas Bakteri Resisten Antibiotik Terhadap Larva Udang
C selama 24-48 jam. Isolat yang diperoleh dikarakterisasi di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, Universitas Sumatera Utara. Alur kerja isolasi bakteri Vibrio sp. dapat dilihat pada Lampiran 4 (hlm37).
Uji patogenitas dilakukan dalam wadah berkapasitas 2 liter yang diisi dengan air laut yang memiliki kadar garam ± 28 ppt sebanyak 1 liter kemudian ditebari larva udang PL 10 sebanyak 20 ekor/wadah dengan metode perendaman. Konsentrasi bakteri resisten dalam wadah dibuat sampai mencapai jumlah sel 108cfu/ml (sesuai dengan standar kekeruhan McFarland). Masing-masing wadah diberi aerasi yang berasal dari blower. Suhu air dalam wadah 30○C dan pH air 7,9. Pemberian pakan dilakukan setiap 12 jam. Patogenitas bakteri resisten diamati melalui kematian larva udang setiap 12 jam selama 96 jam perendaman dan dibandingkan dengan kontrol negatif (tanpa pemberian bakteri resisten). Uji patogenitas ini dilakukan dengan 3 kali ulangan. Alur kerja uji patogenitas bakteri resisten antibiotik dapat dilihat pada Lampiran 5 (hlm 38).
3.8 Uji Daya Hambat Bakteri Resisten Antibiotik terhadap Vibrio sp. Secara In Vitro
Bakteri Vibrio sp.ditumbuhkan pada media NA selama 24 jam. Koloni tunggal yang tumbuh diambil kemudian disuspensi dalam larutan fisiologis sampai mencapai jumlah sel 108cfu/ml lalu disebarkan pada media MHA. Cakram kosong steril ditetesi dengan biakan bakteri resisten sebanyak 10-20 μl (dengan jumlah sel 108cfu/ml) kemudian diletakkan pada media MHA yang berisi isolat Vibrio sp. dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 30±2○C. Zona hambat diukur dengan penggaris pada dua posisi, selanjutnya dirata-ratakan. Pengujian dilakukan dengan 3 ulangan (Muliani et al. 2002). Alur kerja uji daya hambat bakteri resisten terhadap Vibrio sp. secara in vitro dapat dilihat pada Lampiran 6 (hlm 39).
3.9 Uji Tantang Bakteri Resisten Antibiotik Terhadap Bakteri Vibrio sp. Pada
Pemeliharaan Larva Udang
Uji tantang pada penelitian ini menggunakan bakteri resisten dan Vibrio sp. dengan jumlah sel 108
a. Perlakuan 1, yaitu larva udang tanpa diinokulasi bakteri (kontrol negatif)
cfu/ml. Uji tantang dilakukan dalam wadah berkapasitas 2 liter yang disi dengan 1 liter air laut dan ditebari larva udang PL9 sebanyak 20 ekor/wadah. Penelitian ini terdiri atas beberapa perlakuan, yaitu:
b. Perlakuan 2, yaitu larva udang diinokulasi dengan Vibrio sp. (dengan jumlah sel 108
c. Perlakuan 3, yaitu larva udang yang diinokulasi dengan Vibrio sp. dan isolat resisten antibiotik, masing-masing bakteri dengan jumlah sel 10
cfu/ml) (kontrol positif).
8
Untuk menjaga ketersediaan oksigen setiap wadah dilengkapi dengan aerasi. Suhu air dalam wadah pemeliharaan sebesar 35
cfu/ml.
○C, salinitas 27 ppt dan pH air 7,9. Pemberian pakan dilakukan tiap 12 jam. Alur kerja uji tantang bakteri Vibrio sp. dengan bakteri resisten antibiotik pada larva udang dapat dilihat pada Lampiran 7 (hlm 40).
3.10 Rancangan Penelitian dan Analisis Data
Penelitian dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap masing-masing dengan tiga ulangan. Pengamatan larva udang yang mati diamati dalam tiap wadah dilakukan tiap 12 jam selama 96 jam perendaman bakteri kandidat biokontrol (Muliani et al. 2002). Data yang diperoleh dianalisis dengan metode Analysis of Variance (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji Duncan pada α = 0,05% (Gomez &
Gomez 1984 menggunakan SPSS versi 16).
3.11 Pengamatan dengan Scanning Electron Microscopy
Sampel larva udang dari isolat sp2, kontrol positif, dan kontrol negatif yang telah diberi perlakuan pada uji tantang masing-masing direndam dalam larutan caccodylate buffer kemudian setelah 2 jam larutan caccodylate dibuang. Setelah itu sampel ditambah dengan larutan glutaraldehid 2% kemudian setelah 2 jam larutan glutaraldehid dibuang lalu direndam dengan larutan tannic acid 2% selama 1 malam. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan alkohol pada konsentrasi yang bertingkat (direndam dalam alkohol 50% selama 5 menit, alkohol 70% selama 20 menit, alkohol 85% selama 20 menit dilakukan dalam suhu 4○C, alkohol 95% selama 20 menit, ditambahkan alkohol absolut selama 10 menit, dan direndam dalam tersier-butanol selama 10 menit) setiap pergantian konsentrasi pelarut, pelarut sebelumnya dibuang terlebih dahulu. Sampel dibekukan dalam tersier butanol dan dikeringkan dengan alat
freeze drying. Sampel kering ditempel diatas stub dan dibalut dengan ion coater. Stub
BAB IV
