METODE PENELITIAN

METODE PENELITIAN

3.1.Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan selama ± 5 bulan, terhitung mulai dari bulan Maret – Juli tahun 2013 di Laboratorium Penelitian I, Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, Laboratorium Kimia Obat, Laboratorium Formulasi Sediaan SterilFakultas Kedokeran dan Ilmu Kesehatan program studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, BPPT PUSLIT-Serpong, Balitro-Cimanggu Bogor,Pusat Laboratorium Terpadu, LIPI Kimia-Serpong, dan Lab. Forensik Mabes Polri-Jakarta.

3.2.Alat dan Bahan 3.2.1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan penguap, batang pengaduk, piknometer, timbangan analitik (Wiggen Hauser), labu destilasi (alat destilasi), oven (memmert), hot plate (Wiggen Hauser^®), cawan petri, pipet tetes, gelas piala, gelas ukur, kapas, kertas saring, kertas saring bebas abu, erlemmeyer, corong, mikropipet, termometer, vortex, Spektrofotometri UV (Hitachi Type U2910), Gas Chromatography-Mass

Spectrometry (Agilent), mikroskop(Olympus IX71), Atomic Absorption

Spechtrophotometer (Hitachi Z-2000 Polarized Zeeman^®), Atomic Absorption Spechtrophotometer (Spektra AA-880).

3.2.2. Bahan

Ekstrak etanol 70% herba kemangi (Ocimum americanum L.)yang berumur 3 bulan diperoleh dari kebun kemangi di daerah Grogol, Kecamatan Limo, Depok yang telah dideterminasi.Kloroform, aseton, n-heksan, amoniak 10%, petroleum eter, alcohol (etanol 96%), FeCl₃ 1%, , HCl 1%, HCl 10%, HCl pekat, amoniak 25%, HNO₃ pekat, NaOH 5%, H₂SO₄ pekat, H₂SO₄ encer, H₂SO₄ 10N, asam asetat encer, asam perklorat, pertolium eter, eter, pereaksi Meyer,

lempengan Mg, pewarna Anisaldehid, standar eugenol,Nutrien Agar (NA) dan Potato Dextrose Agar (PDA)

3.3.Prosedur Penelitian 3.3.1. Determinasi Tanaman

Pemeriksaan atau determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor, Jawa Barat.

3.3.2. Penyiapan Simplisia

Tanaman kemangi yang diperoleh dari kebun kemangi di daerah Grogol, Kecamatan Limo, Depok yang telah dideterminasi, kemudian disortasi dari bahan-bahan pengotor. Lalu dilakukan pencucian dengan air mengalir hingga bersih, setelah itu dikeringkan dengan cara diangin-anginkan hingga kering (selama ± 2 minggu). Kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender hingga menjadi serbuk dengan ukuran derajat kehalusan serbuk simplisia yang sesuai.Setelah itu disimpan dalam wadah kering tertutup rapat dalam ruangan terlindung dari cahaya matahari.

3.3.3. Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia (Depkes RI, 1979) 3.3.3.1. Uji Makroskopik

Uji makroskopik bertujuan untuk menentukan ciri khas simplisia dengan pengamatan secara langsung berdasarkan bentuk simplisia dan ciri-ciri organoleptik herba kemangi (Ocimum americanum L.) menurut literatur secara umum.

3.3.3.2. Uji Mikroskopik

Uji mikroskopik mencakup pengamatan terhadap bagian simplisia dan fragmen pengenal dalam bentuk sel, isi sel atau jaringan tanaman serbuk simplisia herba kemangi (Ocimum americanum L) secara umum yang dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.

3.3.4. Penyiapan Ekstrak

Serbuk simplisia herba kemangi dimaserasi dengan menggunakan etanol 70% selama 24 jam dan pada 6 jam pertama sekali-sekali dilakukan pengadukan. Hasil maserasi disaring dengan kapas dan kertas saring.Selanjutnya, residu dimaserasi kembali hingga warna coklat bening.Filtrat herba kemangi yang diperoleh disatukan dan dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40⁰C - 50⁰C sampai diperoleh ekstrak kental. Rendemen dari ekstrak kemudian dihitung dengan rumus :

3.3.5. Pengujian Parameter Spesifik 3.3.5.1. Identitas (Depkes RI, 2000)

Pendiskripsian tata nama, yaitu nama ekstrak, nama latin tumbuhan, bagian tumbuhan yang digunakan, dan nama Indonesia tumbuhan.

3.3.5.2. Organoleptik (Depkes RI, 2000)

Penetapan organoleptik yaitu dengan pengenalan secara fisik dengan menggunakan panca indera dalam mendiskripsikan bentuk, warna, bau, dan rasa.

3.3.5.3. Senyawa Terlarut Dalam Pelarut Tertentu

Pengujian senyawa terlarut dalam pelarut tertentu dalam ekstrak terdiri dari kadar senyawa yang terlarut dalam air dan kadar senyawa yang terlarut dalam etanol(Depkes RI, 2000; Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

(i) Kadar Senyawa yang Larut dalam Air

Sejumlah 1 g ekstrak (W1) dimaserasi dengan 25 mL kloroform selama 24 jam, menggunakan labu ukur sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama. Kemudian didiamkan selama 18 jam dan disaring. Filtrat sebanyak 5 mL diuapkandalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara (W0) dengan cara didiamkan sampai pelarutnya menguap dan tersisa residunya,kemudianpanaskan

residu pada suhu 105^oC hingga bobot tetap (W2)(Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

Keterangan :

W0 = bobot cawan kosong W1 = bobot ekstrak awal

W2 = bobot cawan + residu yang dioven

(ii) Kadar Senyawa yang Larut dalam Etanol

Sejumlah 1 g ekstrak (W1) dimaserasi dengan 25 mL etanol 96%, selama 24 jam dengan menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama. Kemudian didiamkan selama 18 jam dan disaring cepat untuk menghindarkan penguapan etanol. Filtrat sebanyak 5 mL diuapkan dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara (W0) dengan cara didiamkan sampai pelarutnya menguap dan tersisa residunya, panaskan residu pada suhu 105^oC hingga bobot tetap (W2)(Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

Keterangan :

W0 = bobot cawan kosong W1 = bobot ekstrak awal

W2 = bobot cawan + residu yang dioven

3.3.5.4. Uji Kandungan Kimia Ekstrak (i) Uji Penapisan Fitokimia

(a) Identifikasi Alkaloid

Ekstrak 0,5 gram dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ditambahkan 5 ml HCl 2 N, dipanaskan pada penangas air. Setelah dingin, campuran disaring dan filtrat ditambahkan beberapa tetes reagen Mayer. Sampel kemudian diamati hingga keruh atau ada endapan (Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, & Vahidipour, 2003).

(b) Identifikasi Flavonoid

Ekstrak 0,5 gram dalam cawan ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ditambahkan serbuk magnesium 0,5 g dan 3 tetes HCl pekat. Terbentuknya warna jingga sampai merah menunjukkan adanya flavon, merah sampai merah padam menunjukkan flavanol, merah padam sampai merah keunguan menunjukkan flavanon (Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, & Vahidipour, 2003).

(c) Identifikasi Saponin

Ekstrak 0,5 gram dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ditambahkan dengan 20 mL aquabides dan dikocok kemudian didiamkan selama 15-20 menit.Jika tidak ada busa = negatif; busa lebih dari 1 cm = positif lemah; busa dengan tinggi 1,2 cm = positif; dan busa lebih besar dari 2 cm = positif kuat (Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, & Vahidipour, 2003; Sarma & Babu, 2011).

(d) Identifikasi Triterpenoid

Ekstrak 0,5 gram dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ditambahkan 1 mL kloroform dan 1 mL asetat anhidrida lalu didinginkan. Setelah dingin, ditambahkan H2^SO4^{. Jika terjadi warna kemerahan,}

menunjukkan adanya triterpenoid (Mandal dan Ghasal, 2012).

(e) Identifikasi Steroid

Ekstrak 0,5 gram dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ditambahkan 2 mL kloroform, kemudian ditambahkan 2 mL H2^SO4 ^{pekat dengan cara diteteskan pelan-pelan dari sisi dinding tabung reaksi.}

Pembentukan cincin warna merah menunjukkan adanya steroid (Mandal dan Ghasal, 2012).

(f) Identifikasi Tanin

Ekstrak 0,5 gram dalam cawan ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ditambahkan FeCl₃ sebanyak 3 tetes, jika menghasilkan biru karakteristik,

biru-hitam, hijau atau biru-hijau dan endapan (Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, & Vahidipour, 2003).

(g) Identifikasi Minyak Atsiri

Ekstrak 2 gram dalam tabung reaksi (volume 20 mL) ditambahkan 10 mL pelarut petroleum eter dan dipasang corong (yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air) pada mulut tabung, dipanaskan selama 10 menit diatas penangas air dan didinginkan lalu disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan cawan penguap hingga diperoleh residu. Residu dilarutkan dengan pelarut alkohol sebanyak 5 mL lalu disaring dengan kertas saring. Filtratnya diuapkan dalam cawan penguap, jika residu berbau aromatik/menyenangkan maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri (Farnsworth, 1966).

(ii) Analisis Komponen Senyawa Kimia dengan GCMS (Agilent MSD ChemStation G1701EA E.02.02.1431)

Analisis komponen senyawa kimia ekstrak dilakukan dengan menggunakan

Gas Chromatography-Mass Spectrometrydengan model number Agilent 19091S-433E yang disuntikkan sebanyak 1,0 mikroliter, dengan kondisi kolom HP-5MS dan temperatur maksimum 350⁰C dengan aliran awal kolom 1,00 ml/min, gas pembawa adalah Helium dengan tekanan kolom 8,57 psi, split rasio 50:1, split aliran 49,0 ml/menit dengan total aliran 52,9 ml/min dan suhu awal 290^oC ditahan selama selama 2 menit dengan aliran 20,0 ml/min sampai seluruh komponen selesai dielusi. Komponen diidentifikasi dengan mencocokkan spektrum massa pada Library seperti Wiley dan Nasional Institute of Standards and Technology (NIST).

(iii) Penentuan Kadar Senyawa Marker (Eugenol) dalam Ekstrak Etanol Herba Kemangi (Ocimum americanum L.)

Penentuan kadar senyawa marker dengan menggunakan senyawa pembanding yaitu eugenol standar. Penetapan ini dilakukan dengan membuat kurva kalibrasi, yang dibuat dengan membuat lima seri konsentrasi eugenol

standar yaitu 12,5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, dan 500 ppm.Kemudian lima seri konsentrasi ini disuntikkan ke alat GCMS sebanyak 1,0 mikroliter dengan spesifikasi alat sama seperti point (ii)), sehingga didapatkan nilai response (luas area) dari berbagai seri konsentrasi. Setelah itu data yang didapat diplot, sehingga didapatkan kurva kalibrasi dan persamaan regresi liniernya.Untuk penetapan kadar senyawa marker (eugenol), data response (luas area) yang didapat untuk eugenol dalam sampel ekstrak yang disuntikan ke alat GCMS sebanyak 1,0 mikroliter kemudian dimasukkan kedalam persamaan regresi linier dan ditetapkan kadar senyawa marker (eugenol) didalam ekstrak.

3.3.6. Pengujian Parameter Non Spesifik 3.3.6.1. Kadar Abu

(i) Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 1 gram ekstrak ditimbang seksama (W1) dimasukkan dalam krus silikat yang sebelumnya telah telah dipijarkan dan ditimbang (W0). Setelah itu ekstrak dipijar dengan menggunakan tanur secara perlahan-lahan (dengan suhu dinaikkan secara bertahap hingga 600 ± 25⁰C (Depkes RI, 1980 dalam Arifin, H., Anggraini, Handayani, & Rasyid, 2006) hingga arang habis.Kemudian ditimbang hingga bobot tetap (W2).

Keterangan :

W0 = bobot cawan kosong (gram) W1 = bobot ekstrak awal (gram)

W2 = bobot cawan + ekstrak setelah diabukan (gram)

(ii) Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu dididihkan dengan 25 ml asam sulfat encer selama 5 menit, kumpulkan bagian yang tidak larut asam. Kemudian disaring dengan kertas saring bebas abu dan residunya dibilas dengan air panas. Abu yang tersaring dan kertas saringnya dimasukkan kembali dalam

krus silikat yang sama. Setelah itu ekstrak dipijar dengan menggunakan tanur secara perlahan-lahan (dengan suhu dinaikan secara bertahap hingga 600 ± 25⁰C (Depkes RI, 1980 dalam Arifin, H., Anggraini, Handayani, & Rasyid, 2006)) hingga arang habis.Kemudian ditimbang hingga bobot tetap (W3).

Keterangan :

W0 = bobot cawan kosong (gram) C = bobot kertas saring (gram) W1 = bobot ekstrak awal (gram)

W2 = bobot cawan + abu yang tidak larut asam (gram)

3.3.6.2. Bobot Jenis

Piknometer yang bersih, kering ditimbang.Kemudian dikalibrasi dengan menetapkan bobot piknometer dan bobot air yang baru dididihkan pada suhu 25^oC kemudian ditimbang (W1). Ekstrak cair diatur suhunya kurang lebih 20^oC lalu dimasukkan ke dalam piknometer kosong, buang kelebihan ekstrak, atur suhu piknometer yang telah diisi hingga suhu 25^oC kemudian ditimbang (W2) (Depkes RI, 2000).

Keterangan : d = bobot jenis

W0 = bobot piknometer kosong W1 = bobot piknometer + air W2 = bobot piknometer + ekstrak

3.3.6.3. Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan dengan cara destilasi toluena. Toluena yang digunakan dijenuhkan dengan air terlebih dahulu, setelah dikocok didiamkan, kedua lapisan air dan toluena akan memisah, lapisan air dibuang. Sebanyak 10 g ekstrak yang ditimbang dengan seksama dimasukkan kedalam labu alas bulat dan ditambahkan toluena yang telah dijenuhkan dengan air. Labu dipanaskan hati-hati selama 100 menit, setelah toluena mulai mendidih, penyulingan diatur 2 tetes/detik, lalu 4 tetes/detik.Setelah semua toluena mendidih,dilanjutkan pemanasan selama 5 menit. Kemudian, dibiarkan tabung menerima dingin sampai temperatur kamar. Setelah lapisan air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dan dihitung kadar air dalam persen terhadap berat ekstrak semula. Pekerjaan diulang tiga kali.(Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011). Keterangan : V = Volume air (ml) W = Bobot ekstrak (gr) 3.3.6.4. Sisa Pelarut

Ektrak mengandung etanol 30% atau kurang. Timbang sejumlah 2,0 gram ekstrak kental dilarutkan dalam air sampai 25,0 ml kemudian dimasukkan kedalam labu destilasi. Atur suhu destilat pada 78,5^oC.Catat destilasi hingga diperoleh destilat lebih kurang 2 ml lebih kecil dari volume cairan uji (destilasi selama 2 jam atau tidak menetes lagi). Tambahkan air sampai 25,0 ml. Tetapkan bobot jenis cairan pada suhu 25^oC seperti yang tetera pada Penetapan Bobot Jenis. Hitung persentase dalam volume dari etanol dalam cairan menggunakan Tabel Bobot Jenis dan Kadar Etanol pada Farmakope Indonesia Edisi IV (Depkes RI, 2000;Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

3.3.6.5. Cemaran Mikroba

Pada penyiapan sampel ditimbang 1 gram ekstrak. Sampel dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml ditambah aquadest sampai 10,0 mL sehingga diperoleh pengenceran 10^-1, dan dikocok hingga larut atau dengan bantuan vortex. Dilanjutkan dengan pengenceran 10^-2 dan 10^-3(Depkes RI, 2000; Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

(i) Angka Lempengan Total (ALT)

Dipipet 1 ml dari tiap pengenceran ke dalam cawan petri yang steril (duplo), dengan menggunakan pipet yang berbeda dan steril untuk tiap pengenceran.Ke dalam tiap cawan petri dituangkan 5 ml media Nutrient Agar yang telah dicairkan bersuhu kurang lebih 45^oC. Cawan petri digoyangkan dengan hati-hati (putar dan goyangkan ke depan dan ke belakang serta ke kanan ke kiri) hingga sampel bercampur rata dengan pembenihan. Kemudian dibiarkan hingga campuran dalam cawan petri membeku.Cawan petri dengan posisi terbalik dimasukkan kedalam lemari inkubator suhu 35^oC selama 24 jam.Catat pertumbuhan koloni pada masing-masing cawan yang mengandung 30-300 koloni setelah 24 jam.Hitung ALT dalam koloni/g sampel dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni pada cawan dengan faktor pengenceran yang sesuai (Depkes RI, 2000; Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

(ii) Kapang dan Khamir

Kedalam cawan petri yang steril (duplo) tuangkan 5 ml media Potato dextros Agar yang telah dicairkan bersuhu 45^oC, biarkan membeku pada cawan. Pipet 0,5 ml dari tiap pengenceran kedalam cawan petri yang steril (metode semai), dengan menggunakan pipet yang berbeda dan steril untuk tiap pengenceran. Cawan petri digoyangkan dengan hati-hati hingga sampel tersemai secara merata pada media. Kemudian diinkubasikan pada suhu kamar atau 25^oC selama 7 hari. Dicatat hasil sebagai jumlah kapang dan khamir/g sampel (Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

3.3.6.6. Cemaran Aflatoksin

Untuk uji kualitatif metode yang dipersyaratkan adalah dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).Ekstrak di KLT dengan menggunakan pembanding campuran aflatoksin B1. Eluen yang digunakan adalah campuran kloroform: aseton: n heksan (83:15:20) dengan jarak rambat 8 cm. Kemudian hasil dilihat pada sinar uv 366 nm, jika terlihat adanya bercak dan warna yang sama (biru atau hijau kebiruan) menandakan positif adanya aflatoksin. Selanjutnya analisa secara kuantitatif dilakukan jika analisa kualitatif positif. Analisa kuantitatif dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).

3.3.6.7. Cemaran Logam Berat

Penetapan kadar Arsen (As), Timbal (Pb) dan Kadmium (Cd) dengan menggunakan alat Atomic Absorption Spechtrophotometer. Penetapan kadar ketiga logam berat dilakukan dengan cara digesti basah. Ditimbang 1 gram ekstrak dan ditambahkan 10 ml HNO3 pekat, kemudian dipanaskan dengan heating mantel hingga kental atau kering. Ekstrak yang kental dan dingin ditambahkan aquadest 10 ml dan asam perkolat 5 ml, kemudian dipanaskan hingga kental lalu disaring ke labu ukur 50 ml. Sampel diukur dengan alat Atomic Absorption Spechtrophotometer. Maksimal residu Pb tidak melebihi 10 mg/kg ekstrak, residu Cd tidak melebihi 0,3 mg/kg ekstrak dan As tidak melebihi 5 μg/kg (Saifudin, Rahayu, & Teruna, 2011).