Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2014 sampai dengan Juli 2016 di Laboratorium Rekayasa Genetika Terapan dan Disain Protein, Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah gen araA penyandi enzim L-AI yang diperoleh dari isolasi bakteri G. sterothermophylus di Tanjung Api, Poso, Indonesia (Fitriani dan Saksono 2010). Vektor pJ912-AGα IP-Free, E. coli DH5α, P. pastoris GS115, enzim restriksi SalI, Kpn2I, NcoI, dan SacI, media tumbuh bakteri LSLB (Low Salt Luria Bertani), media tumbuh khamir YPD (Yeast Potato Dextrose), BMGY (Buffered Glycerol Complex Medium), dan BMMY (Buffered Methanol Complex Medium), antibiotik ampisilin dan zeocin, primer spesifik untuk proses subkloning maupun sekuensing.
Tabel 2 Primer yang digunakan
Primer Sekuen nukleotida (5' → 3')
PPAI-F 5'-GCGTCGACATGCATCACCATCACCATCACATGCTGTC ATTACGTCCTTATGAATTTTGG-3' PPAI-R 5'-GTCACAGTACTCCGCCCCCGCCAAAATACTTCATTCC ATC-3' SeqPPAI-F 5'-CCTTGAGGGTGATTTCGACGTC-3' SeqPPAI-R 5'-GACCTCGGAAGTAGTTCTGTTTCC-3' AOX1-F 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3' AOX1-R 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3' Desain primer menggunakan software online Primer3Plus
Prosedur Penelitian
Konstruksi vektor ekspresi dan sub-kloning
Pada penelitian sebelumnya telah diperoleh gen araA yang mengkode enzim
L-AI yang diisolasi dari isolat G. stearothermophilus asal Tanjung Api, Poso, Indonesia, dan telah dikloning dalam plasmid pET-21b serta digunakan untuk transformasi E.coli DH5α.
Sub-kloning gen araA ke dalam plasmid pJ912-AGα diawali dengan proses amplifikasi gen araA pada plasmid pET-21b. Gen araA diamplifikasi menggunakan pasangan primer PPAI-F dan PPAI-R. Pada gen araA ditambahkan
tag His dan situs restriksi SalI pada ujung 5' serta situs restriksi Kpn2I pada ujung 3'. Gen araA hasil amplifikasi dan plasmid pJ912-AGα kemudian dipotong dengan enzim restriksi SalI dan Kpn2I. Fragmen araA dan plasmid pJ912-AGα yang telah dipotong selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa 1%. Kedua komponen tersebut kemudian diekstraksi dari gel agarosa menggunakan MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). Hasil ekstraksi kemudian diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Ligasi antara gen araA dan plasmid pJ912-AGα
dilakukan menurut protokol umum biologi molekuler (Ausubel et al. 2002). Hasil ligasi kemudian digunakan untuk transformasi E.coli DH5α menggunakan metode kejut panas (heat shock) dan ditumbuhkan pada media seleksi LSLB agar yang mengandung antibiotik zeocin (25µg/mL). Zeocin dipilih karena vektor
pJ912-AGα membawa faktor resisten terhadap antibiotik zeocin.
Gambar 7 Konstruksi vektor PJ912-AGα-araA
Analisis vektor rekombinan dapat dilakukan dengan isolasi plasmid rekombinan dari sel E.coli DH5α yang tumbuh pada media seleksi yang mengandung zeocin (25µg/mL), PCR vektor rekombinan, dan analisis sekuen basa DNA.
Pembuatan sel kompeten Pichia pastoris
Sebanyak 1 mL kultur P. pastoris strain GS115 ditumbuhkan pada media YPD dalam tabung reaksi pada temperatur 30oC selama semalam (overnight). Selanjutkan diinokulasikan 0.1-0.5 kultur yang telah diinkubasi tersebut dalam 50 mL media baru pada flask berukuran 500 mL, dan ditumbuhkan selama semalam hingga diperoleh OD600= 1.3-1.5. Kemudian kultur disentrifugasi pada 1500×g selama 5 menit di temperatur 4oC. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 50 mL akuabidestilata dingin steril. Sentrifugasi dilakukan kembali seperti tahapan sebelumnya dan pelet diresuspensi dengan 25 mL akuabidestilata dingin steril. Proses sentrifugasi dilakukan kembali dan pelet hasil sentrifugasi
diresuspensi dengan 2 mL sorbitol 1M. Kultur kembali disentrifugasi dan selanjutnya pelet diresuspensi menggunakan sorbitol 1M sebanyak 1 mL. Sel kompeten P. pastoris GS115 dapat disimpan dalam kondisi beku sebelum digunakan.
Transformasi P. pastoris melalui elektroporasi
Sebanyak 5-10 μg vektor rekombinan pJ912-AGα-araA dilinearisasi dengan cara dipotong menggunakan enzim restriksi SacI. Hasil pemotongan diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Vektor rekombinan yang telah dipotong dipurifikasi menggunakan MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). Transformasi P. pastoris dilakukan dengan metoda elektroporasi.
Sebanyak 80 µL sel kompeten dan 5-10 µg DNA linier (dalam 5-10 μL air
steril) dimasukkan dalam kuvet elektroporasi steril (2 mm gap) kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit. Selanjutnya elektroporasi dilakukan menggunakan elektroporator (Gene Pulser BioRad, USA). Kondisi elektroporasi adalah kondisi optimal yang disarankan oleh produsen alat (Biorad, USA), yaitu
2000 V, 25 μF, 200 Ω, dan 5 msec. Segera setelah elektroporasi dilakukan, ditambahkan 1 mL sorbitol 1M ke dalam kuvet, dan isi kuvet kemudian dipindahkan ke tube 1.5 mL steril untuk selanjutnya diinkubasi pada temperatur 30oC selama 1-2 jam. Hasil elektroporasi disebar pada cawan media YPDS agar yang mengandung 100 µg/mL zeocin dengan volume beragam pada setiap cawan
(25, 50 dan 100 μL). Cawan diinkubasikan selama 3-10 hari pada temperatur 30oC sampai koloni tumbuh (Invitrogen 2001)
Seleksi koloni P. pastoris transforman
Analisis integrasi gen araA ke dalam genom P. pastoris dilakukan menggunakan teknik PCR koloni. Sebelum dilakukan PCR, koloni khamir rekombinan diberi perlakuan terlebih dahulu. Koloni khamir dicuplik dengan
tusuk gigi steril dan diresuspensikan ke dalam 50 μL NaOH 0.04M. Suspensi
tersebut diinkubasi selama ≥ 5 menit pada temperatur 37°C. Suspensi ini digunakan sebagai sumber DNA dan pasangan primer PPAI-F dan PPAI-R digunakan pada proses PCR. Kondisi PCR yang digunakan adalah 40 siklus dengan kondisi denaturasi pada temperatur 95°C selama 30 detik, penempelan primer pada temperatur 56°C selama 30 detik dan perpanjangan pada temperatur 72°C selama 1 menit. Sebelum siklus PCR, dilakukan denaturasi awal selama 8 menit pada temperatur 95°C dan perpanjangan akhir selama 5 menit pada temperatur 72°C pada akhir siklus.
Ekspresi protein rekombinan
Koloni P. pastoris rekombinan ditumbuhkan pada media agar miring YPD
dengan zeocin 100 μg/mL, kemudian dilakukan uji ekspresi protein rekombinan.
Uji ekspresi protein rekombinan mengikuti prosedur pada manual EasySelectTM Pichia Expression Kit (Invitrogen, 2001). Sebanyak 1 ose koloni P. pastoris
rekombinan diinokulasikan ke dalam 2 mL media cair YPD yang mengandung 100 µg/mL zeocin sedangkan untuk P. pastoris non rekombinan digunakan media
cair YPD tanpa zeocin. Biakan selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada temperatur 30°C dengan agitasi 250 rpm. Biakan yang tumbuh selanjutnya dipindahkan ke 5 mL media BMGY. Biakan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada inkubator bergoyang dengan temperatur 30oC dan kecepatan 250 rpm. Sel khamir dipanen dari media BMGY dengan cara disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3000×g selama 7 menit. Biomassa sel diresuspensi dalam 5 mL media induksi BMMY. Suspensi sel dipindahkan ke dalam 25 mL BMMY baru dengan OD600 awal= 1. Metanol dengan konsentrasi akhir 0.5% (v/v) ditambahkan ke dalam media induksi BMMY setiap 12 jam selama 3 hari untuk menginduksi ekspresi protein rekombinan. Biakan diinkubasi pada temperatur 30°C, dengan kecepatan 250 rpm. Pengambilan contoh untuk analisis dilakukan setiap jam ke-24, 48, dan 72 setelah waktu induksi pertama dan densitas sel (OD600) diukur. Biakan dipanen dengan cara sentrifugasi pada temperatur 4°C, dengan kecepatan 3000×g selama 10 menit.
Analisis ekspresi protein rekombinan dengan Immunofluoresence Sebanyak 10 μL kultur sel (2×109
sel/mL) dicuci dengan 500 μL bufer TBS
(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl [pH7.5]) dan disentrifugasi selama 3 menit pada temperatur4oC dan kecepatan 5000×g. Selanjutnya pelet diresuspensi dalam 300
μL bufer TBS dan kemudian ditambahkan 3 μg FITC-conjugated rabbit polyclonal antibody to His6 (Abcam). Suspensi lalu diinkubasi selama 2 jam pada temperatur ruang di inkubator bergoyang dengan kecepatan 100 rpm. Sel kemudian dicuci dengan 200 μL TBST 0.1% dan setelahnya diresuspensi dalam 300 μL bufer TBS (Berlec et al. 2011). Sel diamati di bawah mikroskop
fluoresence Zeiss Axio Imager.Z2 (Zeiss Axio, Jerman) menggunakan filter FITC.
Gambar 8 Immunofluorescence di permukaan sel khamir
Ekstraksi protein rekombinan dari dinding sel P. Pastoris
Protein rekombinan diekstraksi dengan menggunakan enzim selulase. Biakan sel yang diinduksi metanol selama 72 jam (OD600= ~20) dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 4000×g selama 5 menit. Pelet sel dibersihkan sebanyak dua kali dengan bufer A yang mengandung 1 mM PMSF (phenylmethane sulfonyl fluoride). Pelet sel diberi perlakuan dengan menambahkan 3 % enzim selulase kompleks Cellic® Ctec2 (Novozymes) di dalam 100 mM bufer natrium asetat (pH 5.2) yang mengandung 1 mM PMSF untuk mengekstrak fusi protein α-agglutinin- araA dari dinding sel. Cellic® Ctec2 digunakan sebagai sumber selulase kompleks karena mengandung enzim selulase,
hemiselulase, dan β-glukosidase. Selulase kompleks tersebut yang dapat memutus
ikatan glikosidik pada rantai β-glukan di dinding sel khamir, sehingga protein rekombinan dapat terpisah dari sel. Inkubasi dilakukan selama 4 jam pada temperatur 37°C. Suspensi sel dan enzim kemudian disentrifugasi pada kecepatan 15,000×g selama 10 menit. Selanjutnya bagian supernatan dipipet untuk dipisahkan dari debris sel. Bagian supernatan merupakan bagian yang mengandung protein target. Sampel protein kemudian dianalisis dengan SDS PAGE.
Gambar 9 Pemotongan rantai β-glukan oleh selulase kompleks
Analisis ekspresi protein dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Protein rekombinan yang diekspresikan dianalisis menggunakan SDS-PAGE. Sampel yang dianalisis merupakan supernatan yang telah dipresitasi sebelumnya menggunakan larutan aseton absolut.
Prosedur SDS-PAGE dilakukan sesuai metode Ausubel et al. (2002) dengan pewarnaan coomasie blue. SDS-PAGE dimulai dengan pembuatan gel poliakrilamid. Pembutan gel poliakrilamid dilakukan dengan dua tahap yaitu pembuatan gel stacking dan gel separating. Gel separating dibuat dengan konsentrasi 15% sedangkan gel stacking dibuat dengan konsentrasi 8% (Lampiran 5). Larutan dihomogenkan kemudian dicetak pada kaca elektroforesis hingga menjadi gel. Langkah selanjutnya adalah memasukkan sampel yang telah ditambahkan dengan bufer Laemmli (Tris HCl, bromopenol biru, gliserol, dan SDS) dan telah didenaturasi pada temperature 100oC selama 5 menit ke dalam sumur gel. Pemisahan dilakukan dengan tegangan 90 volt selama 2.5 jam. Protein yang telah terpisah dalam gel kemudian diwarnai menggunakan coomasie blue
selama satu malam, dilanjutkan dengan destaining menggunakan akuadestilata selama 1 jam. Gel poliakrilamid kemudian divisualisasi dengan kamera.
Analisis ekspresi protein permukaaan dengan manik magnet
Analisis ini menggunakan interaksi antara manik magnet Pure ProteomeTM
Nickel Magnetic Beads (Milipore, USA) dengan protein target yang memilliki protein His di permukaan sel khamir. Sebelum digunakan untuk mengikat sel P. pastoris transforman, manik magnet dibersihkan terlebih dahulu. Sebanyak 25 μL suspensi manik magnet dimasukkan ke dalam tube 1.5 mL. Tube diletakkan pada
magnetic stand agar manik magnet terkumpul dan bufer dapat dibuang dengan cara dipipet. Selanjutnya, manik magnet diresuspensi dengan 100 μL bufer
binding dan diinkubasi selama 1 menit di temperatur ruang. Untuk menghilangkan cairan bufer binding, tube diletakkan pada magnetic stand dan bufer dibuang dengan cara dipipet. Proses pembersihan ini dilakukan sebanyak dua kali. Setelah manik magnet bersih, 20 μL manik magnet dicampurkan dengan 20 μL sel P. pastoris transforman dan diinkubasi dengan agitasi rendah selama 1 jam pada temperatur ruang. Sel P. pastoris transforman yang digunakan dalam proses ini merupakan sel yang telah diinduksi dengan metanol dan telah dibersihkan dengan bufer A yang mengandung 1 mM PMSF sebanyak tiga kali. Untuk memisahkan manik magnet dan suspensi sel yang tidak terikat dari manik magnet, tube diletakkan pada magnetic stand dan suspensi sel dipipet keluar. Selanjutnya, manik magnet diresuspensi dengan 100 μL bufer binding dan diinkubasi selama 1 menit di temperatur ruang. Proses ini dilakukan untuk membersihkan manik magnet dari sel yang tidak terikat dan dilakukan sebanyak tiga kali. Manik magnet disuspensi dengan 20 μL bufer TBS dan diamati di bawah Zeiss Axio Imager.Z2 (Zeiss, Jerman).