BAB III MATERI DAN METODE
3.4 Metode Penelitian
3.4.1 Persiapan Kandang dan Pakan Hewan Percobaan
Delapan ekor marmot ditempatkan pada dua buah kandang (kandang A, disebut kelompok A dan kandang B, disebut kelompok B), sehingga masing-masing kandang berisi empat ekor. Kemudian masing-masing-masing-masing kandang diberi identitas sesuai dengan perlakuan yang akan diberikan, Air minum diberikan secara ad libitum, sedangkan pakan yang diberikan adalah konsentrat pakan ikan yang dikombinasi dengan hijauan. Kandang dilengkapi dengan alas yang
berfungsi untuk menampung feses dan urin. Setiap hari alas tersebut dibersihkan untuk menjaga kebersihan, sehingga kesehatan marmot terjaga dan marmot merasa nyaman. Kandang pemeliharaan marmot ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Kandang pemeliharaan marmot.
3.4.2 Vaksinasi
Marmot kelompok A divaksinasi dengan vaksin AI subtipe H5N1 dan marmot kelompok B divaksinasi dengan vaksin AI subtipe H5N2. Kedua vaksin yang digunakan tersebut adalah vaksin inaktif dalam adjuvan. Vaksin tersebut diberikan dengan dosis 1 ml secara subkutan. Vaksinasi dilakukan sebanyak tiga kali dengan interval masing-masing satu bulan. Setelah diperoleh titer antibodi yang cukup, hewan divaksinasi kembali dengan antigen tanpa adjuvan melalui rute intravena (IV) dengan dosis 0,1 ml .
3.4.3 Pengambilan Darah dan Pemisahan Serum
Pengambilan darah dilakukan dua minggu setelah vaksinasi kedua, satu minggu setelah vaksinasi ketiga dan satu minggu setelah vaksinasi dengan antigen tanpa ajuvan. Pengambilan darah dilakukan melalui vena auricularis di daerah telinga. Karena vena tersebut ukurannya sangat kecil, sehingga jarum suntik tidak cukup untuk masuk ke dalamnya, maka pengambilan darah dilakukan dengan cara
menusuk vena tersebut dengan jarum suntik, kemudian darah yang keluar dihisap dengan spoit 3 ml, sampai didapat darah sebanyak satu sampai dua ml. Spoit tersebut kemudian ditutup kembali dan diberi tanda sesuai jenis vaksin yang digunakan.
Setelah didapat cukup darah, spoit ditarik sampai ma ksimal, dan diletakkan dengan posisi miring. Hal ini bertujuan untuk memperbesar luas permukaan darah, sehingga serum akan lebih mudah keluar. Selanjutnya serum ini disimpan dalam refrigerator pada suhu 4 oC selama 24 jam, kemudian serum dipisahka n dengan mengambil cairan bening yang telah memisah. Serum ini kemudian dimasukkan ke dalam microtube dan diberi tanda sesuai dengan jenis vaksin yang digunakan. Apabila serum yang didapat warnanya masih merah, maka harus disentrifugasi sampai didapat serum yang benar-benar jernih dan tidak lagi berwarna merah.
Serum yang diperoleh dari pengambilan darah pertama (dua minggu setelah vaksinasi ke dua) selanjutnya disebut serum I, serum dari pengambilan darah ke dua (satu minggu setelah vaksinasi ke tiga) disebut serum II, dan serum dari pengambilan darah terakhir (satu minggu setelah vaksinasi dengan antigen tanpa adjuvan) disebut serum III.
3.4.4 Pengujian Serum
Serum yang telah didapat harus segera diuji, apabila digunakan pada lain waktu, harus disimpan dalam freezer. Uji yang dilakukan terhadap serum ini adalah untuk mengukur titer antibodi terhadap antigen virus AI H5N1, yaitu dengan uji hemaglutinasi inhibisi (HI). Dan untuk menguji tingkat kehomologan antibodi dalam serum tersebut terhadap antigen AI H5N1, yaitu dengan uji agar gel presipitasi (AGP).
A. Prosedur Uji Hemaglutinasi inhibisi (HI)
Uji HI yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan metode beta dan mikrotitrasi, dengan urutan sebagai berikut :
1. Sebanyak 25 µl NaCl fisiologis (0,85 %) dimasukkan kedalam lubang-lubang microplate yang terdiri dari 96 lubang dengan menggunakan mikropipet.
2. Pada jajaran lubang pertama ditambahkan 25 µl serum-serum yang akan diuji dan serum positif sebagai kontrol (positif) kemudian dilakukan pengenceran serial kelipatan dua dari lubang pertama hingga lubang ke sebelas, sedangkan lubang ke dua belas dipergunakan sebagai kontrol sel darah merah.
3. Sebanyak 25 µl antigen virus AI sebesar 4 HAU ditambahkan pada setiap lubang, kecuali lubang ke dua belas ditambah dengan 25 µl NaCl fisiologis dan selanjutnya dicampur dengan cara menggoyang-goyangkan secara perlahan selama 30 detik kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang.
4. Sebanyak 25 µl suspensi sel darah merah (SDM) ayam 0,5 % ditambahkan ke dalam setiap lubang, kemudian dicampur kembali dan didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang.
Interpretasi hasil titer HI ditunjukkan pada pengenceran serum tertinggi yang masih memberikan hambatan (inhibisi) pada antigen 4 HAU. Inhibisi ditetapkan dengan melakukan pengamatan sel darah merah (SDM) pada lubang-lubang cawan mikro, bila cawan mikro dimiringkan terlihat SDM membentuk tetesan air mata serupa dengan SDM kontrol.
Rataan titer antibodi hasil uji HI dihitung dengan menggunakan Geometric Mean Titer (GMT), dengan rumus :
Log2 GMT = (Log2 t1)(S1) + (Log2 t2)(S2) + ... + (Log2 tn)(Sn) N
Keterangan :
N = Jumlah contoh serum yang diamati
t = Titer antibodi pada pengenceran tertinggi yang masih dapat menghambat aglutinasi sel darah merah
S = Jumlah contoh serum yang bertiter t n = Sampel ke-n
B. Prosedur Uji Agar Gel Presipitasi (AGP)
Prosedur uji Agar Gel Presipitasi adalah sebagai berikut :
1. Pertama-tama disiapkan bahan-bahan agar sebagai berikut : agarose 0,4 g, polietilen glikol 6000 1,2 g, Na azide 0,01 g, 25 ml akuades, dan 25 ml PBS.
2. Semua bahan-bahan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang tahan panas lalu dipanaskan dengan mikrowave pada suhu 100 oC sampai mendidih dan semua bahan tersebut benar-benar homogen, yang ditandai dengan warnanya yang jernih sempurna.
3. Kemudian disiapkan gelas obyek secukupnya, dan dengan menggunakan pipet mohr, bahan agar yang telah dipanaskan (masih dalam keadaan panas) dihisap sebanyak 4 ml, lalu dituang secara hati-hati di atas gelas obyek. Langkah ini diulangi denga n gelas obyek baru, sampai semua bahan agar habis, kemudian ditunggu sampai bahan agar pada obyek gelas tersebut memadat.
4. Setelah agar memadat, selanjutnya dibuat lubang-lubang pada agar tersebut dengan menggunakan cetakan (puncher) yang terdiri dari tujuh lubang berbentuk heksagonal, dalam satu gelas obyek dapat dibuat dua heksagonal.
5. Selanjutnya disiapkan serum yang akan diuji dan suspensi antigen virus AI H5N1.
6. Suspensi antigen dimasukkan ke dalam lubang di bagian tengah heksagonal sebanyak 25 µl, dan serum yang akan diuji dimasukkan ke dalam lubang-lubang pada sudut heksagonal sebanyak 25 µl.
7. Masing-masing gelas obyek ditandai, dicatat, dan digambar untuk keperluan identifikasi.
8. Agar tersebut kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada tempat yang lembab dan suhu ruang. Sebagai inkubator dapat digunakan kotak plastik bertutup, dimana didalamnya diletakkan tisu yang telah dibasahi dengan akuades, dan sterofoam sebagai alas agar diletakkan d atas tisu tersebut.
9. Setelah 24-48 jam hasil uji AGPT dapat dibaca, hasil positif ditunjukkan dengan adanya garis putih (garis presipitasi) yang terbentuk diantara lubang yang berisi antigen dan antibodi (serum), dan hasil positif menunjukkan bahwa antigen dan antibodi dalam serum yang diuji tersebut homolog.
