BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Metode Penelitian
Metode analisis ADN dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahapan yaitu ekstraksi, RAPD dan analisis data. Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7 Bagan Prosedur Penelitian
Ekstraksi DNA
Ya
Tidak
PCR
Ya
Tidak
RAPD
Analisis data
20
3.3.1 Ekstraksi ADN
Ekstraksi ADN pada daun Jati rakyat (Tectona grandis Linn. f) secara umum dilakukan dengan prosedur yang sama dengan kegiatan ekstraksi untuk jenis-jenis pohon kehutanan yang lain. Bahan yang akan dianalisis berupa contoh daun Jati rakyat dengan ukuran 2 x 2 cm digerus dengan menggunakan nitrogen cair di dalam pestel yang bersih sampai membentuk serbuk. Hasil gerusan dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml dan untuk mempercepat proses penghancuran sel secara kimia ditambahkan 500-700 mikro liter larutanbuffer ekstrak dan 100 mikro liter PVP 2%, kemudian campuran tersebut divortex agar menjadi homogen. Selain itu untuk mempercepat proses penghancuran sel secara thermal dilakukan proses inkubasi di dalamwaterbath selama 45 menit – 1 jam pada suhu 65oC, campuran tersebut setiap 15 menit dibolak-balikan agar semua bahan di dalam tube terjadi proses penghancuran sel baik yang terdapat pada bagian atas dan bawah tube. Setelah 45 menit – 1 jam diinkubasi, tube diangkat dan didinginkan selama 15 menit.
Untuk memisahkan antara cairan bahan kimia dengan cairan yang mengandung ADN (supernatant) ditambahkan Chloroform IAA 500 mikro liter dan Fenol 10 mikro liter, kemudian dikocok dan tube disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Cairan yang mengandung ADN (supernatant) dipindahkan ke dalam tube baru, kegiatan atau proses di atas dilakukan dua kali.
Untuk mendapatkan pellet ADN, ke dalam tube yang berisikan supernatant ditambahkan isopropanol dingin 500 mikro liter dan NaCl 300 mikro liter dan disimpan di dalam freezer selama 45 menit-1 jam. Fase padat (pellet) dicuci dengan etanol 100% sebanyak 300 mikro liter yang ditambahkan ke dalam tube untuk memurnikan ADN dari sisa-sisa bahan kimia, proses tersebut dilakukan 2 kali, kemudian dikeringkan dalam desikator ± 15 menit. Larutan TE sebanyak 20 mikro liter ditambahkan untuk mendapatkanpellet ADN yang pekat.
Pengujian kualitas ADN dilakukan setelah pellet ADN larut secara homogen. Untuk menguji kualitas ADN hasil ekstraksi dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1% (b/v). Gel agarose merupakan campuran antara larutan TAE 1X dengan agarose.
21
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt selama kurang lebih 30 menit yang pada prinsipnya dilakukan dengan memigrasikan ADN dalam gel agarose pada tegangan tertentu dari arus (-) atau katoda ke arus (+) atau anoda. Secara visual, hasil elektroforesis dapat menggambarkan tingkat keutuhan genom dan tingkat kontaminasi RNA dalam pellet ADN terisolasi. Apabila kondisi hasil elektroforesis smear menunjukkan bahwa ADN yang diisolasi tidak utuh (terbentuk potongan-potongan pendek) atau ADN yang diperoleh terkontaminasi oleh RNA. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromide, selanjutnya pita ADN hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator. Hasil isolasi meliputi tebal tipis ADN dan ada tidaknya fragmen ADN ataupun RNA. Komposisi bahan untuk ekstraksi yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Komposisi bahan untuk ekstraksi ADN
No Nama Bahan 1 Sampel reaksi X Sampel reaksi
1 Tris-HCl 1 M 100 mikro liter X x 100 mikro liter 2 NaCl 5 M 280 mikro liter X x 280 mikro liter 3 EDTA 0.5 M 40 mikro liter X x 40 mikro liter 4 CTAB 10% 200 mikro liter X x 200 mikro liter 5 Merkapetanol 5 mikro liter X x 5 mikro liter 6 PVP 1% 100 mikro liter X x 100 mikro liter 7 Aquades 280 mikro liter X x 280 mikro liter
3.3.2 Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek ADN yang dihasilkan secara buatan biasanya terdiri antara 10 – 25 nukleotida. (Finkeldey 2005). Primer berfungsi sebagai titik pemula terjadinya reaksi. Sepasang primer yang sekuennya telah ditentukan untuk dapat menemukan sekuen target pada ADN digunakan dalam PCR. Segmen ADN diantara kedua titik pertemuan primer akan diamplifikasi dalam reaksi PCR. Primer berfungsi sebagai titik awal sintesis oleh enzim yang disebut DNA polymerase yang diperoleh dari bakteriThermus aquaticus. Enzim ini juga biasa disebutTaq DNA polymerase. Enzim ini sesuai untuk proses amplifikasi karena
22
dapat bertahan pada suhu tinggi hingga 95oC meskipun suhu optimum bagi aktivitas enzim adalah 72oC. Setelah terjadi annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen ADN melalui proses ekstensi pada suhu 72oC.
Dalam teknik RAPD, umumnya primer yang digunakan berupa oligonukleotida yang memiliki panjang sebesar 10-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki lima basa G dan C. Primer yang mempunyai panjang kurang dari 9-mer dapat digunakan, tetapi akan menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode pewarnaan yang lebih sensitif untuk mendeteksinya.
Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi (primer positif) dan dari primer positif tidak semuanya menghasilkan fragmen ADN polimorfik. Pada kegiatan ini dilakukan survei terhadap 35 primer, yaitu primer dari golongan OPO dan OPY yang diproduksi olehOperon Technology.
Primer dari golongan OPO yaitu dengan memiliki kode primer O.1, O.2, O.4, O.5, O.6, O.7, O.8, O.9, O.10, O.11, O.12, O.13, O.14, O.15, O.16, O.18, O.19 dan O.20. Sedangkan primer dari golongan OPY memiliki kode primer Y.1, Y.2, Y.3, Y.4, Y.5, Y.6, Y.8, Y.9, Y.11, Y.12, Y.13, Y.14, Y.15, Y.16, Y.17, Y.18 dan Y.20. Urutan basa nukleotida primer OPO dan OPY dapat dilihat pada Tabel 5.
23
Tabel 5 Urutan basa nukleotida 35 primer (Operon Technology)
No. Primer Urutan Basa No. Primer Urutan Basa
1 OPO-01 5' GGCACGTAAG '3 1 OPY-01 5' GGTGGCATCT '3
2 OPO-02 5' ACGTAGCGTG '3 2 OPY-02 5' CATCGCCGCA '3
3 OPO-04 5' AAGTCCGCTC '3 3 OPY-03 5' ACAGCCTGCT '3
4 OPO-05 5' CCCAGTCACT '3 4 OPY-04 5' GGCTGCAATG '3
5 OPO-06 5' CCACGGGAAG '3 5 OPY-05 5' AGCCGTGGAA '3
6 OPO-07 5' CAGCACTGAC '3 6 OPY-06 5' AAGGCTCACC '3
7 OPO-08 CCTCCAGTGT '3 7 OPY-08 5' AGGCAGAGCA '3
8 OPO-09 5' TCCCACGCAA '3 8 OPY-09 5' GTGACCGAGT '3
9 OPO-10 5’ TCAGAGCGCC '3 9 OPY-11 5' AGACGATGGG '3
10 OPO-11 5' GACAGGAGGT '3 10 OPY-12 5' AAGCCTGCGA '3
11 OPO-12 5' CAGTGCTGTG '3 11 OPY-13 5' CACAGCGACA '3
12 OPO-13 5' GTCAGAGTCC '3 12 OPY-14 5' GGTCGATCTG '3
13 OPO-14 5' AGCATGGCTC '3 13 OPY-15 5' AGTCGCCCTT '3
14 OPO-15 5’ TGGCGTCCTT ‘3 14 OPY-16 5' GGGCCAATGT '3
15 OPO-16 5' TCGGCGGTTC '3 15 OPY-17 5' GACGTGGTGA '3
16 OPO-18 5' CTCGCTATCC '3 16 OPY-18 5' GTGGAGTCAG '3
17 OPO-19 5' GGTGCACGTT '3 17 OPY-20 5' AGCCGTGGAA '3
18 OPO-20 5' ACACACGCTG '3
3.3.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Proses PCR membutuhkan 4 komponen utama yaitu H2O,Gotaq green master mix,
primer dan cetakan ADN (Tabel 6). Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam tube 0,2 ml. ADN hasil proses ekstraksi sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran dengan menggunakanaquabidest. Besarnya perbandingan antara ADN denganaquabidest tergantung dari tebal dan tipisnya ADN genomik hasil ekstraksi.
Tabel 6 Komposisi bahan untuk reaksi PCR
No Nama Bahan 1 Sampel reaksi X Sampel reaksi
1 H2O 2 mikro liter X x 2 mikro liter
2 Gotaq green master mix 7,5 mikro liter X x 7,5 mikro liter
3 Primer 1,5 mikro liter X x 1,5 mikro liter
24
Dalam proses PCR untuk mengetahui kosentrasi ADN hasil ekstraksi dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose. Hasil dari proses PCR sangat ditentukan oleh primer yang digunakan. Proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (30–60 detik) dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara cepat (Tabel 7).
Tabel 7 Tahapan-tahapan dalam proses PCR untuk teknik RAPD
Tahapan Suhu Waktu Jumlah Siklus
Pre-denaturation 950C 2 menit 1 Denaturation Annealing Extension 950C 370C 720C 1 menit 2 menit 2 menit 45
Final Extension 720C 5 menit 1
Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil dari seleksi. Hasil proses PCR kemudian dianalisis dengan melakukan elektroforesis menggunakan 2,0 % gel agarose dalam larutan buffer 1 x TE dan distaining didalam larutan Ethidium Bromide. Produk PCR dari individu pohon yang berbeda akan menghasilkan panjang sekuen yang berbeda pula. Perbedaan ini akan dapat dideteksi dengan elektroforesis dengan gelagarose.