3 METODOLOGI UMUM
3.4 Metode Penelitian
3.4.1 Rekultur, Reidentifikasi, dan Preparasi Supernatan
Isolat BAL disegarkan dalam 5 mL MRSB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Kultur BAL berumur 24 jam kemudian dipupuk dalam MRS agar dan kembali diinkubasi selama 24 jam. Kultur dalam MRS agar kemudian diidentifikasi secara morfologi dengan pewarnaan Gram dan uji katalase menggunakan H2O2 3%. Isolat dengan karakter gram positif, katalase negatif, dan
tidak memproduksi gas selama fermentasi, lebih lanjut diuji kemampuannya dalam memfermentasi 49 jenis karbohidrat untuk diidentifikasi mengkonfirmasi jenisnya menggunakan kit API 50 CHL (Biomerieux, Perancis). Isolat umur 24 jam digoreskan pada medium MRS agar, selanjutnya disuspensikan pada medium API CHL dan dihomogenisasi. Suspensi isolat pada medium API CHL diteteskan pada API CHL strip yang berisi substrat 49 macam karbohidrat, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 48 jam. Kemampuan isolat dalam memfermentasi substrat diamati pada 24 dan 48 jam inkubasi. Perubahan warna dari biru gelap menjadi kuning dinyatakan sebagai perubahan yang positif. Hasil yang diperoleh diolah dengan menggunakan software API 50 CHL sehingga didapatkan data jenis bakteri yang diuji.
Isolat L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) dan E. coli ATCC 25922 dikonfirmasi dengan pewarnaan Gram dan uji katalase menggunakan H2O2 3%.
Selanjutnya terhadap L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) dilakukan uji API 50 CHL. Isolat L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) hasil identifikasi diinokulasikan ke dalam 100 mL medium MRSB dan diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam (Iyapparaj et al. 2013). Selanjutnya dilakukan pemisahan sel dengan supernatan menggunakan sentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan kemudian disaring menggunakan membran filter 0.2 μm dan disimpan pada suhu 4 oC sebagai stok. Endapan berupa sel ditanam dalam cryoinstant sebagai stok isolat BAL dan disimpan dalam freezer suhu -18 oC. Supernatan sebagai stok siap digunakan dalam setiap tahapan penelitian.
Isolat S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 25922 digunakan sebagai indikator. Terhadap kedua isolat dilakukan rekultur sebelum digunakan. Kedua isolat dibiakkan dalam media BHI broth dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Setelah inkubasi selama 24 jam kemudian kedua isolat ditanam dalam media MRSA dengan beberapa pengenceran hingga diperoleh koloni tunggal. Koloni tunggal yang diperoleh kemudian dilakukan pewarnaan Gram dan uji katalase. Persiapan bakteri asam laktat dan bakteri uji tersebut dimaksudkan untuk mengetahui kemurniannya.
3.4.2 Uji Aktivitas Antibakteri dan Penentuan Kadar Hambat Minimum (KHM)
Menentukan KHM dilakukan dengan menggunakan metode dilusi (Sari et al. 2010; Ratsep et al. 2014). Sebanyak 5 mL larutan uji yang terdiri atas media NB, supernatan L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) dan 6 log cfu mL-1 bakteri patogen dimasukkan ke dalam tabung. Larutan uji dibuat dalam beberapa konsentrasi supernatan yaitu: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, dan 90%. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam. Kemudian diamati pertumbuhannya dengan melihat ada tidaknya kekeruhan pada larutan uji. Selanjutnya dari masing-masing konsentrasi larutan uji diambil 0.1 mL dan disebar ke media spesifik untuk masing-masing jenis bakteri dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Kemudian dihitung jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh. Konsentrasi larutan uji yang tidak ada pertumbuhan bakteri ditetapkan sebagai kadar hambat minimum (KHM) supernatan L. plantarum (L. lactis FNCC 0086).
3.4.3 Pembuatan Dangke
Proses pembuatan dangke dalam penelitian ini menggunakan krim susu sapi yang ditambahkan ke dalam susu sapi segar. Penambahan krim merupakan upaya untuk meningkatkan kadar lemak dangke susu sapi. Krim ditambahkan ke dalam susu sapi dengan kadar lemak 1% dan 2% (g/v) dari volume susu. Kadar lemak dalam krim ditentukan dengan metode Kieferle dan Charlotte (Sudarwanto 2012). Susu kemudian dipanaskan dengan api kecil sampai 70 oC, kemudian ditambahkan getah buah pepaya sehingga terjadi penggumpalan (curd) dan dibiarkan hingga mendidih dan didinginkan. Setelah didinginkan kemudian ditambahkan supernatan L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) dan dibiarkan selama 30 menit. Selanjutnya curd yang terbentuk disaring dan dimasukkan ke dalam cetakan yang terbuat dari tempurung kelapa sambil ditekan-tekan supaya cairannya terpisah. Dangke yang terbentuk kemudian dibungkus dengan daun pisang.
3.4.4 Analisa Proksimat Dangke
Analisis proksimat dangke dilakukan menggunakan Standar Nasional Indonesia (SNI 1992) dan Association of Official Agricultural Chemists (AOAC 1995) untuk mengetahui kadar air dan abu dengan metode gravimetri, kadar lemak dengan metode hidrolisis-Soxhlet, dan kadar protein dengan metode Kjeldahl mikro. Kadar karbohidrat dihitung menggunakan rumus (by difference), yaitu: 100% - % (protein + lemak + abu + air). Nilai pH ditentukan dengan metode SNI (1998).
3.4.4.1 Penentuan Kadar Air
Metode yang digunakan dalam penentuan kadar air ini adalah metode oven dengan menghitung kehilangan bobot sampel setelah pengovenan. Sampel ditimbang sebanyak 1–2 gram di dalam cawan porselen bertutup yang sebelumnya telah diketahui beratnya. Sampel dikeringkan menggunakan cawan porselen dalam oven pada suhu 102–105 oC selama 5–6 jam. Sampel didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang sampai diperoleh berat yang konstan. Perhitungan dalam menentukan kadar air dapat ditentukan melalui persamaan berikut:
Kadar air = W – W1 x 100% W
Keterangan :
W = berat sampel awal (g)
W1 = berat sampel setelah pengeringan (g) 3.4.4.2 Penentuan Kadar Lemak
Mengukur kadar lemak dangke dilakukan dengan menggunakan metode
Soxhlet. Sampel yang sudah dihaluskan, ditimbang 5–10 gram dan kemudian dibungkus atau ditempatkan dalam thimble (selongsong tempat sampel), bagian atas sampel ditutup dengan kapas. Pelarut yang digunakan adalah petroleum spiritus dengan titik didih 60–80 °C. Selanjutnya labu kosong diisi butir batu didih. Setelah dikeringkan dan didinginkan, labu diisi dengan petroleum spiritus 60–80 °C sebanyak 175 mL.
Thimble yang sudah terisi sampel dimasukan ke dalam Soxhlet. Soxhlet
disambungkan dengan labu dan ditempatkan pada alat pemanas listrik serta kondensor. Alat pendingin disambungkan dengan soxhlet. Air untuk pendingin dijalankan dan alat ekstraksi lemak mulai dipanaskan. Ketika pelarut dididihkan, uapnya naik melewati soxhlet menuju ke pipa pendingin. Air dingin yang dialirkan melewati bagian luar kondenser mengembunkan uap pelarut sehingga kembali ke fase cair, kemudian menetes ke thimble. Pelarut melarutkan lemak dalam thimble, larutan sari ini terkumpul dalam thimble dan bila volumenya telah mencukupi, sari akan dialirkan lewat sifon menuju labu. Proses dari pengembunan hingga pengaliran disebut sebagai refluks. Proses ekstraksi lemak kasar dilakukan selama 6 jam. Setelah proses ekstraksi selesai, pelarut dan lemak dipisahkan melalui proses penyulingan dan dikeringkan. Kadar lemak diperoleh melalui selisih berat labu lemak akhir dengan berat labu lemak awal, dibagi dengan berat sampel, kemudian dikalikan 100%.
3.4.4.3 Penentuan Kadar Protein
Sebanyak 0.5–3 g dangke dimasukkan ke dalam labu kjedahl dan didestruksi dengan menggunakan 20 mL asam sulfat pekat dengan pemanasan sampai terjadi larutan berwarna jernih. Larutan hasil destruksi diencerkan dan didestilasi dengan penambahan 10 mL NaOH 10%. Destilat ditampung dalam 25 mL larutan H3BO3 3%. Larutan H3BO3 dititrasi dengan larutan HCl standar
dengan menggunakan metil merah sebagai indikator. Dari hasil titrasi ini total nitrogen dapat diketahui.
Kadar protein dapat ditentukan dengan persamaan berikut: % Protein = B x D x E x F x G x 100%
C A x 1000
Keterangan:
A = berat sampel (g)
B = volum pelarutan hasil destruksi (mL) C = volum yang dipipet untuk destilasi (mL) D = volum larutan penitrasi/HCl (mL) E = normalitas penitrasi/HCL (mL)
F = faktor konversi untuk susu (6.38) G = berat molekul nitrogen (14) 3.4.4.4 Kadar Abu
Sampel ditimbang sebanyak 1–5 g, lalu dimasukkan ke dalam cawan porselen yang sudah diketahui bobot tetapnya. Sampel diarangkan di atas bunsen dengan nyala api kecil hingga berasap, selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 500–600 oC sampai menjadi abu yang berwarna putih. Cawan yang berisi abu didinginkan dalam desikator dan dilakukan penimbangan hingga diperoleh bobot tetap. Kadar abu dapat dihitung dengan rumus:
Kadar abu (%) = Berat abu (g) x 100% Berat sampel (g)
3.4.5 Penambahan Supernatan L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) sebagai Biopreservasi
Supernatan yang digunakan berasal dari hasil fermentasi L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) yang telah diuji senyawa aktivitas antibakterinya. Perlakuan penambahan biopreservasi ke dalam dangke antara lain:
a. Dangke tanpa penambahan supernatan L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) (kontrol negatif)
b. Dangke dengan penambahan supernatan L. plantarum (L. lactis FNCC 0086)(perlakuan)
Kadar supernatan L. plantarum (L. lactis FNCC 0086) yang digunakan sebagai preservasi merupakan nilai kadar hambat minimum (KHM) yang diperoleh dari Tahap 1.
3.4.6 Mengukur Kadar Lemak dalam Krim
Kadar lemak dalam krim terlebih dahulu ditentukan dengan metode Kieferle dan Charlotte (Sudarwanto 2012). Untuk mengukur kadar lemak dalam krim dibutuhkan nilai kadar air krim. Untuk mengukur kadar air krim, terlebih dahulu mengeringkan cawan porselen dan menimbangnya sebelum melakukan pengerjaan. Selanjutnya memasukkan 5 gram krim ke dalam cawan porselen dan menimbang kembali untuk memperoleh berat krim dalam cawan. Sampel dipanaskan sampai terbentuk warna kecokelatan pada endapan yang bukan lemak lalu didinginkan dalam eksikator. Kemudian menimbang berat cawan porselen beserta sisa krim yang telah diuapkan airnya. Pengerjaan tersebut diulang beberapa kali hingga mendapatkan berat krim yang konstan. Setelah diperoleh berat krim yang konstan kemudian dihitung kadar airnya untuk kemudian menghitung kadar lemak krim dengan rumus:
Kadar lemak dalam krim (%) = 100 – (kadar air x 1.1)%
Setelah diketahui kadar lemak dalam krim, kemudian dihitung kebutuhan krim yang akan ditambahkan ke dalam susu sapi untuk menetapkan penambahan lemak 1% dan 2%. Kebutuhan krim yang ditambahkan menggunakan rumus:
Keterangan:
M1 = kadar lemak dalam krim
M2 = kadar lemak yang ditentukan (1% atau 2%)
V1 = volume krim yang dibutuhkan
V2 = volume susu
3.4.7 Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri Uji
Jumlah koloni dinyatakan dengan colony forming unit (cfu) per gram atau per mL atau luasan tertentu dari contoh (cm2) (Morton 2001; Waluyo 2007). Perhitungan dilakukan menurut ketentuan Standard Plate Count (SPC). Perhitungan terhadap E. coli ATCC 25922 dilakukan dengan menggunakan metode tuang menggunakan medium VRB agar, sedangkan terhadap S. aureus ATCC 25923 menggunakan medium VJA.
3.4.8 Analisis Sensori
Analisis sensori terhadap dangke susu sapi dengan penambahan lemak dan supernatan dilakukan dengan menggunakan indera manusia untuk mengukur warna, tekstur, aroma, dan rasa dangke (Setyaningsih et al. 2010; Marimuthu et al. 2013). Atribut sensori tersebut diuji dengan uji perbandingan pasangan (Lampiran 5) dengan pembanding dangke susu kerbau. Atribut sensori juga dilakukan terhadap mutu dan daya simpannya menggunakan uji skoring selama penyimpanan produk pada suhu ruang (Lampiran 6 dan 7). Uji skoring dilakukan setiap hari sampai terdeteksi adanya kerusakan produk berupa adanya lendir, jamur, dan produk menjadi basi. Pengujian sensori dibantu oleh 9 panelis agak terlatih yang dianggap peka dalam menilai mutu dan daya simpan dangke (Dzarnisa 1999; Jinjarak et al. 2006).
Sebelum melakukan uji sensori, dilakukan beberapa persiapan agar data yang diperoleh tidak bias. Persiapan meliputi: persiapan panelis, laboratorium pengujian, dan persiapan contoh. Untuk menjadi anggota panel dilakukan seleksi panelis dengan persyaratan yaitu: memiliki kepekaan indrawi yang baik, sehat, memiliki waktu luang, berpengetahuan luas tentang produk dangke, memiliki ketertarikan pada bidang pengujian, serta memiliki kemampuan ilmu dasar tentang analisis sensori.