4.1.Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan dalam tiga tahap yaitu: penelitian lapangan (ekplorasi), laboratorium dan Rumah kaca. Penelitian lapangan meliputi pengambilan sampel tanaman dan tanah. Penelitian laboratorium mencakup penghitungan jumlah spora, identifikasi endomikoriza, pengamatan kolonisasi akar, dan analisa tanah. Penelitian rumah kaca meliputi optimasi propagasi/perbanyakan spora endomikoriza, uji efektifitas spora dan propagul pada bibit mente (A.occidentale L.) dan optimasi media pembawa endomikoriza. Penelitian secara keseluruhan bulan April 2011 – Juni 2012.
Lokasi pengambilan sampel dilakukan pada dua lokasi perkebunan mente yaitu di Desa Sendang Kecamatan Grograk Kabupaten Buleleng dan Desa Sukadana Kecamatan Kubu Kabupaten Karang Asem. Penelitian laboratorium dilakukan pada Laboratorium Tanah Fakultas pertanian Unud untuk analisa sifat fisika-kimia tanah, Laboratorium UPT Analitik Universitas Udayana untuk analisa kandungan P tanaman uji dan Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Jurusan Biologi F-MIPA Unud untuk penyaringan dan penghitungan spora pada tanah sampel, karakterisasi dan identifikasi endomikoriza, prosessing seluruh sampel akar tanaman, mengamati dan menghitung prosentase kolonisasi endomikoriza. Penelitian lanjutan dilakukan di Laboratoriun Taksonomi Tumbuhan Rendah LIPI Cibinong Bogor untuk identifikasi endomikoriza tingkat spesies. Penelitian di rumah kaca Fakultas Pertanian Universitas
Udayana untuk perbanyakan spora endomikoriza, aplikasi dan optimasi media pembawa endomikoriza pada bibit mente (Anacardium occidentale L.). Alur penelitian pada Gambar 4.1:
Gambar 4.1. Alur Skema Penelitian 1. Eksplorasi endomikoriza - Kawasan : Karangasem & Buleleng - Tanaman mente dan tanaman sela yang ditanam petani setempat
- Waktu: satu periode musim
2.Faktor lingkungan: fisika kimia lingkungan :
keasaman (pH) tanah , kandungan bahan organik ( N.P, K, C), kadar air tanah
1. Identifikasi endomikoriza 2. Menghitung jumlah spora, % kolonisasi mikoriza pada akar tanaman 1. Perbanyakan spora :
Jenis spora dan penurunan konsentrasi P dalam hara Johnson 2. Optimasi endomikoriza pada bibit mente : Formulasi inokulan
(spora dan propagul)
Berat inokulan 3. Optimasi media Formulasi jenis media pembawa HASIL 1. *Jumlah spora * Formula optimum 2. *Respon bibit mente
* Media optimum *Berat inokulan (jumlah spora) *Jenis inokulan *Jenis endomikoriza yang terbaik 3. Jenis media pembawa
spora yang terbaik
Observasi
Lapangan Uji Labo-ratorium Rumah KacaUji Skala
HASIL 1. Jenis –jenis endomikoriza 2. Kerapatan populasi spora endomikoriza 3. % kolonisasi endomikoriza Luaran Jangka Panjang: Produksi masal pupuk hayati endomikoriza indigenus Bali Luaran: Formula endomikoriza indigenus Bali pada bibit mente
4.2. Prosedur Penelitian 4.2.1. Penelitian di lapangan
Sampel tanah dan akar tanaman (bagian serabut akar) di ambil pada kedalaman 20-30 cm sesuai acuan Widiastuti (2004). Sampel akar tanaman yaitu: Mente (A.occidentale), Jagung (Zea mays), Kacang Koma (Lablab purpureus), Singkong (Manihot uttilissima) dan Kacang Undis (Cajanus cajan) di ambil dari lokasi perkebunan di desa Sendang Kecamatan Kubu dan sampel akar tanaman Mente (A. occidentale), Jagung (Zea mays), Kacang Undis (Cajanus cajan), Singkong (Manihot utilissima) dan Cabai Kecil (Capsicum frutescens). diambil dari perkebunan mente di desa Sendang Kecamatan Gerograk. Tiap jenis tanaman yang digunakan sebagai sampel sebanyak lima tanaman (25 tanaman/lokasi), pengambilan sampel dilakukan secara periodik tiap dua bulan selama satu periode musim sehingga pengambilan sampel di lapangan sebanyak enam kali (April 2011 – Februari 2012).
Sampel tanah diambil untuk isolasi spora endomikoriza, akar tanaman untuk melihat kolonisasi pada akar diproses di laboratorium Taksonomi Tumbuhan Rendah Jurusan Biologi F-MIPA Unud. .Sampel tanah tiap lokasi untuk analisa kandungan tanah dianalisis di Laboratorium Tanah Fakultas Pertanian Unud dan UPT Laboratorium Kimia Analitik Universitas Udayana Bali (dilihat pada prosedur 4.2.3).
4.2.2. Penelitian di laboratorium
Penelitian laboratorium terdiri dari Identifikasi endomikoriza, penghitungan kolonisasi dan penghitungan jumlah spora. (Alur skema penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.1.).
4.2.2.1. Karakterisasi dan identifikasi jenis mikoriza 4.2.2.1.1. Isolasi spora dan penghitungan jumlah spora
Isolasi spora dilakukan menggunakan Metode Penyaringan Basah (Brundrett et al., 2008) sebagai berikut: Tanah sebanyak 250 g direndam dalam 1 liter air (rasio 1:4), diaduk agar spora yang melekat pada partikel tanah dapat terlepas, dibiarkan selama 10 menit agar mengendap. Supernatan dituang dalam saringan bertingkat merk ”Analysensieb Eckhardt 5657 Haan W. Germany“dengan ukuran pori saringan (500 μm, 300 μm, 200 μm, 63 μm dan 45 μm). Supernatan dicuci di bawah air mengalir sampai jernih dan didapatkan spora-spora endomikoriza. Spora-spora dituangkan pada cawan petri, diamati di bawah mikroskop disekting-set, dihitung menggunakan counter. Spora yang telah dihitung jumlahnya kemudian dipisah-pisahkan berdasarkan perbedaan morfologi spora (warna, ukuran dan bentuk) disimpan dalam botol kaca berisi aquadest steril pada refrigerator (suhu 5oC) untuk dilakukan identifikasi.
4.2.2.1.2.Identifikasi jenis endomikoriza
Identifikasi dilakukan berdasarkan karakter morfologi (bentuk, diameter, warna, pola dan jumlah lapisan dinding spora, ornamentasi dinding spora, bentuk/pola perkecambahan spora pada proses pembentukan hifa.) dan reaksi dinding spora apabila ditetesi larutan Melzer dan Polivinil alcohol-lacto gliserol (PVLG) menggunakan acuan dari Walker (1983); Kramadibrata et al (1983); Schenck et al. (1984); Schenck dan Perez (1990); Morton dan Benny (1990); Schϋβler et al., (2001), INVAM (2005); Kramadibrata (2008) dan Brundret et al., (2008). Identifikasi secara morfologi di laboratorium Taksonomi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA Unud dilakukan sampai tingkat
genera. Spora-spora yang tidak bisa teridentifikasi sampai tingkat spesies disimpan dalam air steril dan sebagian spora tetap ditumbuhkan dalam tanaman inang (Zea mays) supaya spora endomikoriza tetap hidup. Identifikasi sampai tingkat spesies dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Rendah LIPI. Cibinong Bogor. Spora-spora yang telah diidentifikasi disimpan dalam botol berisi air steril dan ditaruh di kulkas untuk digunakan dalam penelitian propagasi/perbanyakan spora di rumah kaca. Proses ini dilakukan menurut acuan INVAM (2005) dan Brundrett et al. (2008).
4.2.2.1.3. Persentase kolonisasi endomikoriza pada akar tanaman
Penghitungan persentase kolonisasi endomikoriza pada akar digunakan prosedur dari Kormanik dan Mc.Graw (1982) yang dimodifikasi. Sampel akar diproses secara berurutan dalam beberapa tahap yaitu clearing, staining dan destaining. Proses clearing; akar yang muda (serabut) tiap sampel tanaman direndam larutan KOH 10% selama 24-48 jam atau sampai akar berwarna kuning bersih transparant. Akar yang berwarna pekat setelah direndam larutan KOH 10%, direndam kembali dalam larutan hipoklorit 10% selama 12 - 24 jam untuk menghilangkan zat warna akar. Setelah akar terlihat transparan, akar dibilas air mengalir sampai akar tidak terasa licin. Akar diasamkan dengan larutan HCl 1% selama 30 menit (Proborini, 1998). Larutan HCl 1% berfungsi untuk mempermudah penempelan zat pewarna pada akar dan hifa. Proses staining dilakukan setelah larutan HCl 1% dibuang, diganti dengan larutan staining (gliserol, asam laktat, aquades perbandingan 2 : 2 : 1 dan ditambah trypan blue (0,05%). Sampel akar didedahkan 24-48 jam atau sampai akar terwarnai (tergantung tiap spesies tanaman). Pewarna trypan blue berfungsi
untuk mewarnai hifa, vesikel atau arbuskul di dalam akar. Larutan staining dibuang, diganti larutan destaining (larutan staining tanpa trypan blue) untuk mengurangi kelebihan intensitas warna sehingga bagian korteks akar dan miselium endomikoriza tampak jelas pada pengamatan di bawah mikroskop Dissectingset dan Binokuler. Sampel akar yang telah terwarnai, ditempatkan pada cawan petri yang telah diberi grid-line (0.5 x 0.5 cm2), dihitung persentase kolonisasi mikoriza pada lajur vertikal dan horizontal menggunakan counter. Persentase kolonisasi mikoriza pada akar dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: