Penelitian ini dibagi dalam dua tahap pekerjaan yaitu tahap pertama adalah penelitian pendahuluan dan tahap kedua adalah penelitian utama. Penelitian pendahuluan meliputi preparasi sampel, pembuatan tepung daging keong mas, dan
pembuatan ransum. Tahap penelitian utama meliputi persiapan kandang, masa adaptasi hewan percobaan, pengukuran bobot tikus, pengambilan darah, dan analisis hemoglobin. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir tahap penelian Keongmas Analisis proksimat Analisis proksimatdan Fe Pembuatan tepung Pencampuran dengan ransum komersil
Masa perlakuan tikus : pemberian makan setiap hari dan penimbangan badan setiap
dua hari selama 28 hari
Pengambilan darah setelah 28 hari pemeliharaan tikus
Analisis hemoglobin Pemisahan cangkang,
daging dan jeroan
Perhitungan rendemen
3.3.1 Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan meliputi preparasi sampel, pembuatan tepung daging keong mas, dan pembuatan ransum.
1) Preparasi sampel
Preparasi sampel merupakan tahap pertama yang dilakukan pada penelitian ini. Preparasi dimaksudkan untuk memisahkan daging keong mas dari cangkangnya. Setelah cangkang, daging, jeroan dipisah kemudian dilakukan perhitungan rendemen dan analisis proksimat keong mas. Analisis proksimat dimaksudkan untuk mengetahui kandungan kimia keong mas yang meliputi kadar air, abu, lemak dan protein.
2) Tahap pembuatan tepung keong
Pembuatan tepung keong mas diawali dengan memisahkan daging dan jeroan keong mas. Daging dan jeroan yang sudah terpisah kemudian dimasukan ke oven dengan suhu 75-80oC selama 24 jam, setelah daging kering kemudian dijadikan tepung menggunakan alat penepung. Tepung daging dan daging + jeroan kemudian dilakukan analisis proksimat (meliputi kadar air, abu, lemak dan protein) dan kandungan Fe.
3) Tahap Pembuatan ransum
Pembuatan ransum dimulai dengan pembelian ransum komersil, ransum komersil berasal dari Fakultas peternakan IPB. Ransum kemudian dianalisis komposisi kimianya yang meliputi kadar air, abu dan lemak dan protein dan Fe. Untuk memenuhi kebutuhan nutrisi tikus dilakukan simulasi formulasi perhitungan dengan metode trial and eror sehingga nutrisi tikus sesuai dengan kebutuhannya (lampiran 6), dari hasil perhitungan tepung daging keong mas yang harus dicampurkan dengan ransum komersil sebanyak 10% dari bobot ransum komersil. Setelah dicampurkan masing-masing ransum perlakuan kemudian diuji komposisi kimia.
3.3.2 Penelitian utama
Langkah penelitian utama meliputi persiapan kandang, masa adaptasi hewan percobaan, masa perlakuan tikus selama 28 hari, pengambilan darah, dan analisis hemoglobin. Penelitian utama akan menguji pengaruh konsumsi keong mas terhadap kadar hemoglobin tikus percobaan selama 28 hari pemberian ransum.
1) Persiapan kandang
Tahap penelitian utama dimulai dengan persiapan kandang. Kandang yang yang digunakan dilengkapi dengan tempat makan dan tempat minum (Lampiran 8) dan diberi alas sekam padi dan berlokasi pada tempat yang bebas dari keributan.
2) Masa adaptasi hewan percobaan
Setelah persiapan kandang selanjutnya adalah masa adaptasi hewan percobaan selama 7 hari. Masa ini bertujuan untuk membiasakan tikus terhadap lingkungan percobaan, untuk menghindari resiko timbulnya gangguan dan stres dan untuk mengamati apakah tikus masih layak digunakan selama percobaan atau tidak.
3) Masa perlakuan tikus
Tikus dibagi dalam tiga kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 9 ekor tikus. Tikus-tikus tersebut dikandangkan sendiri-sendiri pada kandang non metabolik. Tikus diberi makan dan minum secara ad libitum atau disediakan secara terus menerus setiap hari selama 28 hari, dan berat badan tikus ditimbang setiap dua hari sekali. Ketiga kelompok tikus dengan perlakuan ransum adalah sebagai berikut:
A : ransum komersil
B : ransum komersil + daging keong mas
C : ransum komersil + daging dan jeroan keong mas 4) Pengambilan darah dan analisis kadar hemoglobin
Tahap selanjutnya adalah pengambilan darah dan analisis kadar hemoglobin. Pengambilan darah tikus dilakukan melalui ekor tikus , sebelum pengambilan darah disediakan tabung reaksi dengan penambahan Etilen diamin tetraasetat (EDTA) 1-1,5 mg. Fungsi EDTA tersebut adalah sebagai antikoagulan. Setelah itu darah kemudian dianalisis kadar hemoglobinnya. 3.4 Analisis Penelitian
Penelitian ini perlu dilakukan beberapa analisis diantaranya analisis proksimat, analisis kadar Fe, analisis kadar hemoglobin dan uji parasit. Berikut ini adalah uraian analisis tersebut.
3.4.1 Analisis proksimat
Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk menghitung komposisi kimia suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar air, abu,lemak, dan protein.
1) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 oC selama 5 jam, kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air ditentukan dengan rumus :
% Kadar air =
× 100% Keterangan :
A = Berat cawan kosong (gr) B = Berat cawan dengan keong (gr)
C = Berat cawan dengan keong setelah dikeringkan (gr).
2) Kadar abu (AOAC 2005)
Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 600 oC, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Perhitungan kadar abu ditentukan dengan rumus :
% Kadar Abu =
x 100 % Keterangan:
A = Berat cawan abu porselen kosong (g) B = Berat cawan abu porselen dengan keong (g)
3) Kadar protein (AOAC 2005)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan setengah butir kjeltab dan 10 ml H2SO4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 400 oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan akuades sampai 100 ml dan 10 ml NaOH 40 %, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi campuran 25 ml asam borat (H3BO3) 2 % dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah berwarna hijau kebiruan maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCL 0,1 N samapai terjadi perubahan warna hijau menjadi merah anggur. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut :
% N =
x 100 %
% protein = % N x Faktor konversi (6,25) Keterangan fp = Faktor pengencer
4) Kadar lemak (AOAC 2005)
Contoh seberat 5 gram dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana), kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak
kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai beratnya konstan.
% kadar lemak =
x 100 % Keterangan: W1 = Berat sampel (g)
W2 = Berat labu lemak kosong (g) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (g)
3.4.1 Analisis mineral Fe (APHA 2005)
Prinsip penetapan mineral, yaitu sesudah penghilangan bahan-bahan organik dengan pengabuan basah terlebih dahulu. Proses pengabuan dilakukan dengan sampel ditimbang sebanyak 1 gram, kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer 150 ml. Ke dalam labu ditambahkan 5 ml NHO3 dan dibiarkan selama semalam dalam keadaan sampel tertutup, kemudian ditambahkan 0,4 ml H2SO4 pekat. Ditambahkan 2-3 tetes campuran HCLO4 dan NHO3 (2:1), sampel tetap berada diatas hotplate karena pemanasan terus berjalan hingga terjadi perubahan warna. Setelah ada perubahan warna, pemanasan tetap dilanjutkan 10-15 menit. Sampel dipindahakan, didinginkan, dan ditambahkan 2 ml akuades dan 0,6 ml HCL pekat. Larutan contoh kemudian diencerkan menajdi 100 ml dalam labu takar. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan menggunakan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan.
Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Spektrofotometer serapan atom (AAS) sehingga absorpsi atau emisi logam dapat dianalisa dan diukur pada panjang gelombang tertentu. panjang gelombang untuk mineral Fe adalah 248,3 nm.
3.4.2 Analisis kadar hemoglobin (Dacie dan lewis 1991).
Metode yang digunakan untuk mengukur kadar hemoglobin dalam penelitian ini adalah metode Cyanomethemoglobin. Metode ini berdasarkan pada pencampuran darah dalam larutan yang mengandung kalium sianida dan kalium ferisianida (Lampiran 9). Absorbansi dari
campuran ini diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Lampiran 10) pada panjang gelombang 541 nm.
3.4.3 Uji parasit (Kusumamihardja 1992)
pengujian parasit dilakukan untuk mengetahui keberadaan parasit-parasit pada keong mas. Deteksi keberadaan parasit-parasit dalam keong mas dilakukakan secara kualitatif dengan menggunakan metode pengapungan sederhana ( Lampiran 11).