3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biofisika Departemen Fisika, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Fakultas Kedokteran Gigi (FKG) Universitas Indonesia sejak bulan Juli 2010 sampai dengan bulan Mei 2011. 3.2 Bahan dan Alat
3.2.1 Bahan
Bahan yang digunakan dikelompokan menjadi dua. Pertama bahan untuk sintesis BCP dan ACP yaitu kalsium oksida (CaO) dari cangkang telur ayam, pro-analis diamonium hidrofosfat ((NH4)2HPO4), dan aquabides. Kedua bahan yang digunakan dalam uji sitotoksisitas dan preparasi SEM adalah cell line NHDF fibroblas, medium kultur:
6
dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin streptomycin, fungizone, trypsin EDTA, trypan blue, phosphate buffered saline (PBS), MTT [3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide], acidified isopropanol, larutan NaCl, 8% glutaraldehyde, dan ethanol. 3.2.2 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, furnace, heating plate, reaktor hidrotermal, buret, vacum, pH meter digital, beaker glass, crucible, mortar, kertas saring, magnetic stirrer, aluminium foil, gelas ukur, erlenmeyer, gamma radiation sterilization dengan sumber radiasi cobalt-60 (Lampiran 6), 0.2 µm-
sterile syiringe filter (Corning, Germany), 50 mL-syringe (Terumo, Japan), tube 15 mL and 50 mL (Falcon, USA), scrapper, mikropipet (Eppendorf, Germany), tips micropipette, tube eppendorf (Axygen, USA), hemocytometer, inkubator (Memert), cell culture dish (35 mm×10 mm), 96-well plates (NUNC, Denmark ), mikroskop (Nikon Elipse 80i), biohazard safety cabinet (ESCO Micro PTE Ltd.), water bath, centrifugasi (Sorvall), vortexer (Bio-rad BR 2000), shaker (Certomat), scanning electron microscope (SEM), dan bio-rad microplate reader benchmark visible spectrophotometer. 3.3 Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian yang dilakukan terdiri atas 4 tahap yaitu sintesis BCP, sintesis ACP, uji sitotoksisitas, dan karakterisasi. Penelitian ini diawali dengan kalsinasi cangkang telur selama 5 jam pada suhu 1000oC untuk menghasikan CaO yang akan digunakan pada sintesis BCP dan ACP.
3.3.1 Sintesis BCP
Sintesis BCP dilakukan dengan metode hidrotermal. Larutan (NH4)2HPO4 0,67 M sebanyak 100 ml ditambahkan setetes demi setetes kedalam 100 ml larutan CaO 1 M. Reaksi ini dilakukan
pada suhu 300oC selama 8 jam dan diaduk dengan magnetic stirrer dengan kecepatan putaran 300 rpm. Selanjutnya, hasil hidrotermal diendapkan selama 12 jam pada suhu kamar dan disaring di dalam vakum. Sampel basah yang telah disaring kemudian dikeringkan dalam furnace pada suhu 110°C selama 5 jam. Bubuk kering yang diperoleh dihaluskan dengan mortar dan sintering pada 1000°C selama 6 jam.
3.3.2 Sintesis ACP
Sintesis ACP akan dilakukan dengan metode presipitasi suhu rendah. Seratus mililiter (NH4)2HPO4 0,06 M akan ditambahkan setetes demi setetes ke dalam 100 ml larutan CaO 0,1 M. Reaksi ini akan dilakukan selama 8 jam sambil diaduk dengan magnetic stirrer pada kecepatan 300 rpm. Hasil presipitasi akan disaring menggunakan vakum dan dikeringkan menggunakan freeze dryer selama 2 x 24 jam.
3.3.3 Analisis Sitotoksisitas
Persiapan in vitro diawali dengan sterilisasi BCP dan ACP. Material disimpan dalam botol kaca dan setiap botol terisi 2 mg lalu disterilisasi menggunakan radiasi sinar gamma pada dosis 25 kGy. Sebelum melakukan analisis in vitro seluruh alat dan bahan yang akan digunakan diseterilisasi dengan menggunakan sinar ultraviolet (UV) selama 15 menit, dan seluruh prosedur kerja dilakukan dalam biohazard cabinet. 3.3.3.1 Kultur Sel
Medium dasar untuk kultur sel adalah DMEM yang disuplemen dengan 10% FBS, penicillin streptomycin dan fungizone. Semua komponen medium dasar tersebut dalam keadaan beku, untuk itu perlu dicairkan terlebih dahulu menggunakan waterbath pada suhu 37°C selama 15 menit. Sel fibroblas diambil dari tempat penyimpanan nitrogen cair (-198°C) dan langsung diinkubasi di dalam medium dasar selama 24 jam pada suhu 37°C. Selanjutnya, sel dicuci dengan
PBS dan ditambah de EDTA agar pelekatan cawan lepas. Tryps waktu agar dapat be diinkubasi kembali s sebelum dilakukan pr dipindahkan ke tub ditambahkan medium da kemudian disentrifugas 2000 rpm selama 10 me terkonsentrasi menjadi supernatant hasil sentri ditambahkan 5 ml me proses homogenisasi beberapa kali agar terbe
Hasil homogenisa kedalam cawan petri medium kultur lengkap cawan petri mencapai tersebut dimasukan dal suhu 37oC selama 48 bertambah banyak, m tersebut siap dipanen (har 3.3.3.2 Menghitung K
Larutan sel seba 10 µl, dan 10 µl trypa dalam 1,5 ml tabung epp
dengan 1 ml trypsin tan sel pada dasar psin membutuhkan bekerja maka sel selama 10 menit proses scrapping, ube 15 ml, dan dasar. Tube tersebut asi dengan kecepatan menit (24°C) agar sel njadi pellet. Cairan ntrifugasi dibuang dan edium dasar untuk i dengan pippeting
bentuk larutan sel. nisasi sel dipindahkan
ri dan ditambahkan ap hingga volum di i 7 ml. Cawan perti dalam incubator pada 48 jam. Setelah sel maka sel fibroblas
harvesting). ng Konsentrasi Sel
banyak 80 µl, FBS ypan blue dicampur eppendorf. 10 µl dari
larutan dalam tabu dipindahkan pada papa glass (Gambar 7). Perhi dilakukan dalam papan glass dibawah mikrosk perbesaran 40x. Hemo mempunyai bagian- menghitung sel seperti pa B, C, D, dan E adalah dihitung secara di ba optik. Perhitungan kons digunakan memenuhi per
Konsentrasi sel V1 C1 = V2 C2
Gambar 7 Skema pembagi
hemocytometer g
Gambar 8 Skema 96-well plates MTT assay.
D C A 7 abung eppendorf pan hemocytometer
rhitungan sel akan pan hemocytometer oskop optik dengan mocytometer glass
-bagian untuk pada Gambar 7. A, lah letak sel yang bawah mikroskop onsentrasi sel yang persamaan 3 dan 4:
10 10 5 (3) (4)
gian pada papan
r glass. E B
8
Suspensi sel disiapkan dengan konsentrasi 2×105 sel/ml dan dipindahkan pada 96 well plates sebanyak 1 ml setiap wellplate. Gambar 8 menunjukkan skema percobaan sampel pengujian toksisitas. Serbuk BCP danACP dibubuhkan pada well plates dan diinkubasi selama 1, 2, dan 3 hari pada setiap sampel sebagaimana skema yang ditunjukkan pada Gambar 8. Tahap inkubasi dilanjutkan dengan pemberian larutan MTT pada setiap well plate sebanyak 1 µl yang langsung diinkubasi kembali selama 3 jam. Serbuk MTT dilarutkan dengan menggunakan larutan NaCl. Tahap selanjutnya adalah pemberian larutan isopropanol dan pengocokan dengan menggunakan alat shaker selama 1 jam. Kode sampel A adalah sampel blank yang hanya mengandung medium dasar, kode sampel B adalah sel dalam medium (kontrol), kode sampel C adalah sampel BCP yang dibubuhkan pada sel, kode sampel D adalah sampel ACP yang dibubuhkan pada sel. Volum larutan sel yang dipersiapkan, yaitu 5 ml. Konsentrasi sel yang diperoleh dari Persamaan 3 (C1) disetarakan dengan konsentrasi dan volum yang diinginkan (V2, C2) menggunakan Persamaan 4 untuk memperoleh volume V1 yang harus diambil dari 5 ml larutan sel.
Uji MTT assay menunjukkan nilai presentase perbandingan nilai absorbansi dari sampel (BCP dan ACP) terhadap kontrol sebagai viabilitas fibroblas cell line dengan menggunakan persamaan In vitro Technologies sebagai berikut:
!"
# $ "% 100% (5)
Jika presentase viabilitas sel jauh lebih kecil dari viabilitas sel kontrol, maka material yang dipaparkan pada sel tersebut dinyatakan bersifat toksik.24
3.3.3.3 Preparasi Sampel untuk Karakterisasi SEM
Prepapasi sampel ini diawali dengan kultur sel seperti pada analisis sitotoksisitas. Untuk karakterisasi ini sampel dipanen dari media kultur kemudian sampel dicuci dalam PBS, lalu sampel difiksasi dengan menambahkan 2,5% glutaraldehid, setelah itu dibilas dua kali dengan PBS dan dehidrasi etanol secara berurutan (seri). Sampel kemudian dikeringkan pada suhu kamar (27oC) dan dilapisi dengan logam emas sebelum analisis SEM.
3.3.4 Pengujian Sampel 3.3.4.1 Karakterisasi XRD
Karakterisasi XRD menggunakan Shimadzu XRD610 diffractrometer dengan sumber Co-60. Pola XRD ditunjukkan oleh grafik intensitas terhadap sudut 2θ, dengan kisaran 10o-
80° dengan laju 0,02o/sekon. 3.3.4.2 Analisis Sitotoksisitas
dengan Metode MTT Assay Absorbansi sel dianalisis mengunakan visible spectrophotometer (Bio-Rad Microplate Reader Benchmark) pada panjang gelombang 655 nm. Hasil akhir yang diperoleh dari nilai absorbansi dapat menggambarkan kemampuan viabilitas sel terhadap sampel.
3.3.4.3 Karakterisasi SEM
Karakterisasi SEM dilakukan untuk mengamati interaksi sel dengan sempel pada setiap periode kultur. Hasil dari preparasi sampel dengan perendaman in vitro 1, 3, dan 14 hari. Morfologi sampel yang diamati terlebih dahulu dilapisi oleh emas-paladium (80% Au dan 20% Pd). Proses pelapisan menggunakan ion 1100 sputter JFC - mesin. Setelah itu sampel dapat dilihat morfologinya dengan menggunakan mikroskop elektron (SEM- EDS, JEOL JCM-35C) dengan perbesaran 5.000x, 10.000x, 20.000x, dan 40.000x