3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai Oktober 2021 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
3.2 Bahan-bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan untuk isolasi jamur endofit adalah akar tanaman kelapa (Cocos nucifera Linn.) dan pinang (Areca catechu Linn.). Akar dari kedua tanaman tersebut diperoleh dari tanaman yang tumbuh di sekitar Kampus Universitas Sumatera Utara dan wilayah Kelurahan Padang Bulan. Jamur uji Ganoderma boninense diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi Universitas Sumatera Utara. Jamur G. boninense dikultivasi dan diperbanyak pada medium Potato Dextrose Agar (PDA). Medium-medium digunakan dalam penelitian ini adalah medium untuk isolasi jamur endofit yaitu Potato Dextrose Agar (PDA) dengan komposisi (g L-1) adalah potato extract 40 g, glukosa 20 g, agar 15 g, akuades 1000 ml. Medium untuk produksi senyawa anti jamur yaitu medium Potato Dextrose Broth (PDB) komposisinya adalah potato extact 4 g, glukosa 20 g, akuades 1000 ml. Medium uji kemampuan kitinolitik yaitu medium Colloidal Chitin Bromocresol Purple (CCBP) komposisinya adalah MgSO4. 7H2O 0,3 g, (NH4)SO4 3,0 g, KH2PO4 2,0 g, koloidal kitin 4,5 g/l, Tween-80 200 µL, bromocresol purple 0,15 g, akuades 1000 ml. Medium untuk uji kemampuan glukanolitik adalah medium glukan agar. Komposisi medium glukan adalah laminarin 90% 6 g, KH2PO4 0,9 g, K2HPO4 0,39 g, NaCl 1,5 g, (NH4)2SO4 0,3 g, MgSO4. 7H2O 0,072 g, ekstrak kamir 0,9 g, agar bakto 12 g dan akuades 600 ml.
3.3 Isolasi Jamur Endofit
Isolasi jamur endofit dari akar tanaman kelapa dan pinang dilakukan dengan prosedur yang dilakukan oleh Yurnaliza et al (2014). Sampel akar yang
12
diperoleh dari lapangan dimasukkan ke dalam plastik steril, kemudian dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi untuk dilakukan isolasi jamur endofit. Akar tanaman dicuci dengan air mengalir selama 20 menit, kemudian dipotong-potong sepanjang 1-2 cm. Sterilisasi permukaan akar dilakukan dengan cara merendam potongan akar secara berurutan dengan larutan etanol 75% selama 2 menit, larutan natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit. Terakhir akar dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali dan dikeringkan di atas kertas saring steril.
Potongan akar selanjutnya diletakkan pada media PDA yang telah dicampur dengan antibiotik kloramfenikol dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3-6 hari.
Koloni yang muncul disubkultur pada media PDA yang baru untuk dilakukan pemurnian.
3.4 Uji Antagonis Jamur Endoft dari Akar Terhadap Ganoderna boninense
Uji antagonis jamur endofit isolat akar kelapa dan pinang terhadap jamur Ganoderma boninense dilakukan dengan metode dual culture. Jamur endofit dan G. boninense ditumbuhkan dalam cawan petri yang berisi medium PDA. Kedua inokulum jamur ditempatkan pada dua titik yang berlawanan dengan jarak sejauh 3 cm. Cawan petri yang ditumbuhi kultur jamur tersebut diinkubasi selama 5 hari dan diamati setiap hari zona hambat pada perubahan pertumbuhan G. boninense yang terjadi. Kemampuan jamur endofit menghambat pertumbuhan G. boninense diukur berdasarkan nilai selisih ukuran jari-jari pertumbuhan miselium G.
boninense kearah jamur uji dengan ukuran jari-jari miselium jamur G. boninense yang teruji. Hasil pengukuran dapat dihitung dengan menggunakan persamaan (Yurnaliza et al., 2014).
% Hambatan Pertumbuhan Miselium= R1 – R2 × 100%
R1
R1 :Jari-jari koloni jamur patogen yang berlawanan arah dengan jamur endofit R2 :Jari-jari koloni jamur patogen yang arah pertumbuhan mendekati koloni
jamur endofit.
13
3.5 Karakterisasi Jamur Endofit Yang Berpotensi
Isolat jamur endofit yang memiliki persentase hambatan >50% kemudian dipilih dan dilakukan ke tahap selanjutnya yaitu karakterisasi secara makroskopis dan mikroskopis. Karakterisasi jamur endofit secara makroskopis meliputi bentuk koloni, warna koloni, kecepatan pertumbuhan. Pengamatan secara mikroskopis meliputi bentuk hifa, bentuk koloni dan ada tidaknya spora aseksual. Identifikasi dilakukan berdasarkan buku identifikasi jamur yang ada antara lain adalah buku Barnet dan Hunter (1972).
3.6 Mekanisme Antagonis Jamur Endofit
Jamur endofit dengan potensi antagonistik tinggi dikoleksi sebanyak 2 isolat dari setiap sampel dan selanjutnya dievaluasi mekanisme antagonis dari masing-masing isolat secara in-vitro. Kemampuan antagonis jamur endofit yang akan dilihat adalah kemampuan produksi senyawa antijamur berupa metabolit sekunde enzim kitinase dan glukanase
3.6.1 Kemampuan Antijamur
Jamur endofit terpilih ditumbuhkan pada media PDA. Produksi antijamur di medium Potato Dextrose Broth (PDB) dilakukan dengan menginokulasikan isolat jamur endofit dan diinkubasi selama 5 hari dalam orbital shaker dengan kecepatan 110 rpm. Setelah diinkubasi ditambahkan 10 ml larutan etil asetat untuk mengikat senyawa antijamur pada saat pengguncangan. Fraksi etil asetat kemudian dikumpulkan dan diuapkan hingga diperoleh ekstrak kering. Ekstrak etil asetat dilarutkan dengan dimetil sulfoksida (DMSO) dan diambil sebanyak 30 µL dan diteteskan pada kertas cakram steril. Kertas cakram yang telah ditetesi kemudian ditempatkan pada sisi luar koloni G. boninense dengan jarak 0,5 cm dari pinggir miselium. Dibuat kontrol dengan kertas cakram yang hanya berisi DMSO. Kemudian hambatan miselium dicatat dan dihitung dengan rumus (Yurnaliza et al., 2014).
14
% Hambatan Pertumbuhan Miselium = R1 – R2 × 100%
R1
R1 : Jari-jari pertumbuhan miselium G. boninense ke arah kontrol R2 : Jari-jari pertumbuhan miselium G. boninense ke arah perlakuan
3.6.2 Aktivitas Kitinase
Isolat jamur endofit diambil pada bagian tepi koloni, dipotong dengan menggunakan cork borer kemudian diinokulasikan secara steril pada medium Colloidal Chitin Bromocresol Purple (CCBP). Kultur jamur diinkubasi pada suhu ruang selama 6-7 hari. Kemudian pembentukan warna ungu yang terlihat pada medium di sekitar koloni jamur dicatat dan didokumentasikan (Yurnaliza et al., 2014). Semakin kuat warna ungu yang terbentuk menandakan kemampuan kitinolitik jamur semakin tinggi.
3.6.3 Aktivitas Glukanase
Isolat jamur endofit yang telah dipotong menggunakan cork borer akan diuji aktivitas glukanolitiknya dengan cara diinokulasikan pada medium glukan agar yang mengandung laminarin 1%, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 hari dengan suhu 28ºC. Zona bening yang dihasilkan dari sekitar koloni merupakan aktivitas glukanase dari jamur endofit setelah diteteskan pewarna congo red 0,1% dan NaCl 1M pada medium. Sebanyak 1 tetes pewarna congo red 0,1% diteteskan dan diinkubasi selama 5 menit diruang gelap. Akan terlihat warna bening pada permukaan setelah dibilas dengan NaCl 1M. Kemudian hitung indeks glukanolitik dengan rumus (Sarimunggu, 2019):
Indeks glukanolitik: 𝐴−𝐵
𝐵
A: Diameter zona bening B: Diameter koloni
15
BAB 4