Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari 2009 hingga Juni 2009, dengan penelitian pendahuluan dilaksanakan dari bulan Juni 2008 sampai dengan Desember 2008.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan adalah Rancangan Acak lengkap (RAL) dengan tiga kali pengulangan. Koloni ESC yang diberi perlakuan adalah 24 koloni yang dibagi dalam 3 kelompok perlakuan. Sebagai perlakuan adalah (1) DMEM+CML10, (2) DMEM+CML0, dan (3) DMEM (sebagai kontrol). Adapun DMEM adalah Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium yang diberi tambahan 5 l/ml penicillin-streptomycin (Sigma, USA), 1% nonessential amino acids
(Sigma, USA), dan 0.1 mM -mercaptoethanol; CML10 berasal dari medium kultur primer cardiomyocyte yang diinduksi dengan 10 ng/ml LIF; CML0 berasal dari medium kultur primer cardiomyocyte tanpa induksi LIF.
Ketiga medium perlakuan tersebut diberikan pada saat pengarahan ESC menjadi cardiomyocyte. Parameter yang diamati adalah tingkat diferensiasi (pengarahan) ESC menjadi cardiomyocyte dengan cara pengamatan langsung terhadap jumlah area berdenyut setelah hari ke-7 kultur diferensiasi hingga hari ke-14 serta kemampuan ekspresi Nkx2.5 dan -MHC dari cardiomyocyte hasil pengarahan ESC, yang dilihat secara kualitatif dari intensitas pita cDNA hasil RT-PCR mRNA pada gel agarose.
18
Tahapan dan Prosedur Kerja
Pembuatan Conditioned Medium
Conditioned medium (CM) didapatkan dari cairan supernatan medium kultur primer cardiomyocyte dari mencit putih (Mus musculus) betina galur ddy
umur 1-3 hari (neonatal). Isolasi cardiomyocyte dilakukan menurut Lin et al.
(2005). Bagian ventrikel jantung dicacah halus menjadi berukuran 1-2 mm dengan menggunakan pisau bedah (Surgical Blade No.10, General Care). Kemudian jaringan diinkubasi selama beberapa waktu dalam Dulbecco’s Phosphatase-Buffered Saline (dPBS) (Gibco, USA) yang mengandung tripsin 0.25% (Gibco, Canada) dan EDTA 1mM (Merck, Darrnstadt, Germany) selama 15 menit pada suhu 37°C. Suspensi sel disaring dan dicucikemudian disentrifus dengan kecepatan 200 g selama 8 menit. Pelet yang didapatkan kemudian dikultur pada cawan petri yang telah berisi medium kultur, yaitu Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Sigma, USA) yang diberi tambahan 20%
fetal bovine serum (FBS) (Sigma, USA), 5 l/ml penicillin-streptomycin (Sigma, USA), 1% nonessential amino acids (Sigma, USA), dan 0.1 mM
-mercaptoethanol (Sigma, USA). Kultur kemudian diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37oC dan kadar CO2 5% selama 2 jam. Supernatan, yang berisi sel-sel yang tidak melekat pada cawan petri, dipindahkan ke cawan petri baru yang berisi medium kultur dan diinkubasi kembali selama 2 jam. Hal tersebut dilakukan sebanyak 2 kali ulangan. Setelah itu dilakukan penanaman akhir sel-sel tersebut pada cawan petri yang telah dilapisi 0.1% gelatin (Sigma, USA).
Setelah 48 jam, medium kultur primer cardiomyocyte diganti dengan medium kultur bebas serum dan dikultur selama 24 jam. Kemudian kultur primer
cardiomyocyte tersebut dikultur dalam medium kultur yang diinduksi leukemia inhibitory factor (LIF) (Sigma, USA) dengan konsentrasi 0 dan 10 ng/ml.
Conditioned medium (CML0 dan CML10) ditampung pada hari ke-4 sampai ke-7 dan disimpan pada suhu 4oC sebelum digunakan untuk perlakuan pada pengarahan ESC.
Penyediaan Embryonic Stem Cell
a. Superovulasi dan isolasi blastosis hasil fertilisasi in vivo
Mencit yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih (Mus musculus) betina galur ddy umur 8-12 minggu sebanyak 10 ekor tiap ulangannya. Superovulasi dilakukan menurut Nagy et al. (2003), dengan menyuntikan secara
intraperitoneal 5 IU Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin (PMSG) (Intervet International BV, Folligon, Boxmeer, Holland) lalu diikuti 46 jam kemudian dengan menyuntikan 5 IU Human Chorionic Gonadotropin (hCG) (Intervet International BV, Chorulon, Boxmeer, Holland). Setelah penyuntikan hCG, setiap mencit betina dikawinkan dengan mencit jantan dengan perbandingan 1:1. Keesokan harinya, dilakukan pemeriksaan vaginal plug untuk mengidentifikasi mencit yang melakukan perkawinan (terjadi kopulasi). Mencit-mencit yang memiliki vaginal plug disatukan dalam satu kandang dan dilakukan pemanenan embrio tahap blastosis pada hari keempat setelah penyuntikan hCG. Blastosis dipanen dengan cara membilas tanduk rahim (kornua uterus) dengan medium dPBS. Sambil dievaluasi di bawah mikroskop stereo (Nikon, SMZ-2T, Japan), blastosis dicuci berturut-turut dalam medium dPBS dan DMEM masing-masing sebanyak 2 kali ulangan. Selanjutnya blastosis dikultur dalam medium DMEM, yang diberi tambahan 10% FBS (Sigma, USA), 5 l/ml penicillin-streptomycin
(Sigma, USA), 1% nonessential amino acids (Sigma, USA), dan 0.1 mM
-mercaptoethanol (Sigma, USA), kemudian diinkubasi dalam inkubator (Sanyo, MCO-95, Japan) dengan suhu 37oC dan kadar CO2 5%.
b. Isolasi inner cell mass
Isolasi inner cell mass (ICM) dilakukan menurut Nagy et al. (2003) dengan beberapa modifikasi. Embrio yang telah mencapai stadium blastosis dihilangkan zona pellucida-nya dengan menggunakan enzim pronase 0.25% selama 7-10 menit, kemudian blastosis dipindahkan ke dalam medium dPBS untuk menghentikan aktivitas pronase. Selanjutnya blastosis tanpa zona pellucida
tersebut dicuci dalam DMEM tanpa serum sebanyak dua kali. Isolasi ICM dilakukan dengan menginkubasi blastosis tanpa zona pellucida dalam rabbit anti-mouse antibody (Sigma, USA) selama 90 menit dan complement sera from guinea pig (Sigma, USA) selama 90 menit dalam inkubator dengan suhu 37oC dan kadar
20
CO2 5%. Kedua serum yang digunakan terlebih dahulu telah dilarutkan dalam DMEM tanpa serum dengan perbandingan volume 1:3. Setelah terpisah dari sel-sel trofoblas, ICM sel-selanjutnya dipindahkan ke dalam DMEM kultur untuk menghilangkan pengaruh serum dan menghilangkan sisa-sisa sel trofoblas yang masih menempel pada ICM.
c. Kultur embryonic stem cell
Setelah diisolasi, ICM dikultur dalam cawan petri yang telah dilapisi 0,1% gelatin (Sigma, USA). Medium kultur ESC yang digunakan adalah DMEM high glucose (Sigma, USA) yang diberi tambahan 20% FBS (Sigma, USA), 1%
nonessential amino acids (Sigma, USA), 5 l/ml penicillin-streptomycin (Sigma, USA), 0.1 mM -mercaptoethanol (Sigma, USA), dan 20 ng/ml mLIF (Sigma, USA) (Passier & Mummery 2005). Medium kultur diganti setiap 2-3 hari dan pada hari ke-7 dilakukan pengecekan uji pluripotensi dari ICM yang telah berproliferasi dengan menggunakan pewarnaan alkaline phosphatase.
d. Pewarnaan alkaline phosphatase
Pewarnaan ini merupakan uji pluripotensi terhadap ESC (O’Connor et al. 2008). Proses pewarnaan dimulai dengan mengeluarkan medium kultur dari cawan petri kemudian koloni-koloni ICM dicuci dua kali dalam dPBS lalu difiksasi dengan 4% paraformaldehide (dalam PBS) selama 20 menit pada suhu ruang. Sel-sel yang terfiksasi dicuci dua kali dengan PBS dan diinkubasi dengan larutan substrat AP yang mengandung 200 g/ml naphtol AS-MX phosphate
(Sigma) dan 1 mg/ml Fast Red TR Salt (Sigma) dalam 100 mM Tris Buffer, pH 8.2, selama 30 menit pada suhu ruang, kemudian koloni-koloni ICM dicuci dalam dPBS. Sel-sel yang berwarna merah menandakan positif AP dan mengindikasikan bahwa sel-sel tersebut masih bersifat pluripoten.
Pengarahan Embryonic Stem Cells menjadi Cardiomyocyte
Pengarahan ESC atau tahap diferensiasi diawali dengan tripsinasi seluruh koloni ICM hasil kultur selama 7 hari (0.25% tripsin dalam dPBS selama 1 menit), kemudian sel-sel hasil tripsinasi tersebut dibagi ke dalam 3 cawan petri yang telah dilapisi dasarnya dengan 0.1% gelatin (Sigma, USA). Medium kultur yang digunakan adalah medium kultur ESC tanpa penambahan LIF. Setelah 2
hari kultur akan terbentuk embryoid bodies (EB) dari kumpulan ESC pada tiap-tiap cawan petri. Selanjutnya EB tersebut kemudian dikultur dalam medium perlakuan selama 14 hari. Medium perlakuan yang dimaksud adalah DMEM+CML10, DMEM+CML0, dan DMEM. Perbandingan antara DMEM dengan CML10 serta DMEM dengan CML0 adalah 1:1.
Kemampuan Ekspresi Gen Cardiomyocyte
Pembuktian terjadinya ekspresi gen pada cardiomyocyte yang didapatkan dari hasil pengarahan ESC, dilakukan deteksi mRNA dari Nkx2.5 dan -MHC
dengan menggunakan metode Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR). Keduanya berturut-turut merupakan faktor transkripsi dan gen yang menghasilkan protein-protein sitoplasmik yang spesifik pada jantung (Kumar et al. 2005).
Setelah diferensiasi hari ke-14, seluruh koloni ESC, khususnya koloni ESC yang memiliki area berdenyut (Bin et al. 2006), diekstrak total RNA-nya dengan menggunakan TRIZOL® (Invitrogen). Mula-mula cawan petri yang berisi EB dicuci dengan dPBS dingin sebanyak 2 kali kemudian dimasukkan 1 ml Trizol. Agar proses lisis pada sel-sel lebih sempurna maka dilakukan pengikisan dasar cawan petri dengan menggunakan cell scraper, setelah itu diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Seluruh larutan isi cawan petri tadi dipindahkan ke dalam tabung 2 ml lalu ditambah dengan 200 l kloroform, dicampur dan diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. Larutan kemudian disentrifus 12,000 g selama 15 menit pada suhu 4oC. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro baru kemudian ditambahkan 500 l isopropil alkohol (isopropanol), dicampur hingga homogen kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Larutan kemudian disentrifus 12,000 g selama 20 menit pada suhu 4oC, supernatan yang didapat dibuang dan pelet RNA dikoleksi. Pada pelet yang didapat ditambahkan etanol 75% dalam DPECdH2O (dingin) sebanyak 1,000 l kemudian dihomogenkan dengan vortex dan disentrifus 12,000 g selama 20 menit pada suhu 4oC. Etanol (supernatan) dibuang dengan hati-hati dan pelet dikeringkan selama 15-20 menit pada suhu ruang. Ke dalam pelet yang telah kering, ditambahkan 30
22
l RNAse free water dan siap digunakan untuk amplifikasi PCR atau disimpan pada suhu -20oC sebelum digunakan untuk amplifikasi PCR.
Reaksi RT-PCR menggunakan SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen). Primer yang digunakan adalah Nkx2.5 dan -myosin heavy chain ( -MHC) (Tabel 1).
Tabel 1 Primer yang Digunakan dalam RT-PCR
Primer Urutan Basa Produk
Nkx2.5 AGC AAC TTC GTG AAC TTT G (sense)
CCG GTC CTA GTG TGG A (antisense) 345 bp
-MHC ACC GTG GAC TAC AAC AT (sense)
CTT TCG CTC GTT GGG A (antisense) 288 bp Sumber: Takahashi et al. (2003).
Total campuran reaksi RT-PCR adalah 25 l yang terdiri 12.5 l 2x
reaction mix, 0.5 l MgSO4, 2 l primer sense, 2 l primer antisense, 1 l
Platinum Taq, dan 7 l total RNA. Campuran tersebut dihomogenkan kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR (GeneAmp PCR System 9600) dengan program yang dapat dilihat pada Lampiran 3.
Produk PCR dianalisis pada gel agarose 1.5% yang mengandung ethidium bromide (EtBr) 1.25 l/ml. Elektroforesis dilakukan pada voltase 100 volt selama 30-50 menit. Hasil elektroforesis dibaca dengan UV illuminator viewer.
Analisa Data
Data yang bersifat kualitatif akan disajikan secara deskriptif, sedangkan data kuantitatif akan diuji secara statistik menggunakan ANOVA (analysis of variance) dan dilanjutkan dengan uji Duncan untuk menentukan beda nyata antar perlakuan. Analisis akan menggunakan software SPSS 17.0 for windows dan MS Office Excell 2003.