Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2013 sampai Januari 2014. Sampel berasal dari tambak nila di Waduk Jatiluhur, Purwakarta. Uji proksimat dilakukan di Laboratorium Balai Besar Pascapanen Pertanian, Cimanggu, Bogor. Analisis jaringan dilakukan di Laboratorium Histologi Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Analisis asam amino dilakukan di Laboratorium Terpadu IPB, Baranang Siang, Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah baby fish nila dengan umur panen 2 minggu, 3 minggu, dan 4 minggu. Analisis proksimat menggunakan bahan aquades, H2SO4, NaOH, HCl, H3BO4 dan pelarut heksana. Bahan yang digunakan dalam analisis asam amino adalah natrium hidroksida, asam borat, larutan brij-30 30 %, 2-merkaptoetanol, larutan standar asam amino 0,5 mikromol/mL, Na EDTA, methanol, aquades, Na-asetat, tetrahidrofuran (THF) dan larutan ortoftalaldehid. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis jaringan, larutan FAA (Formaldehida, Asam asetat glasial dan Alkohol), etanol absolut, TBA (Tertier Butil Alkohol), minyak parafin, parafin, xilol, hematoksilin, eosin, etanol, larutan seri Johansen.
Analisis proksimat menggunakan alat berupa cawan porselen, oven, desikator (analisis kadar air); tabung reaksi, gelas erlenmeyer, tabung kjeldhal, tabung sokhlet, pemanas (analisis kadar lemak); tabung kjeldhal, desikator, destilat, dan buret (analisis kadar protein); cawan porselen, tanur, dan desikator (analisis kadar abu). Analisis asam amino menggunakan alat labu takar, ampul, oven, syringe, pipet mikro, timbangan digital, erlenmeyer, water bath, mortar, kertas saring milipore, vial, dan high performace liquid chromatrography (HPLC) Shimadzu RF 20A. Alat untuk analisis jaringan adalah gelas penyimpan sampel, meja cetak,
karton cetak, oven, mikrotom Yamoto RV-240, meja pemanas, gelas obyek, dan rak pewarna. Sedangkan untuk proses pengamatan digunakan mikroskop cahaya merk Olympus CX41 dan kamera mikroskop merk Olympus DP12.
Metode Analisis
Penelitian diawali dengan pengambilan sampel dalam keadaan hidup. Sampel ditimbang kemudian dilakukan analisis morfometrik baby fish nila pada umur 2, 3, 4 minggu setelah pendederan masing-masing sebanyak 30 ekor, selanjutnya dilakukan analisis proksimat, dan asam amino. Analisis proksimat, dan asam amino dilakukan pada kondisi segar dan utuh dengan umur 2 minggu, 3 minggu, dan 4 minggu. Proses analisis proksimat mengacu pada SNI 1992-01-2891. Komposisi asam amino ditentukan dengan metode HPLC Shimadzu RF 20A yang mengacu pada AOAC 2005. Analisis jaringan menggunakan metode parafin yang mengacu pada Angka et al. (1990).
Gambar 1 Diagram alir kerangka penelitian
Analisis Proksimat
Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar air, abu, lemak, protein dan abu tak larut asam.
1) Analisis kadar air (SNI 1992-01-2891)
Cawan porselen dikeringkan dalam oven selama 30 menit, lalu cawan didiamkan dalam desikator selama 15 menit. Selanjutnya cawan ditimbang hingga menunjukkan berat yang konstan. Selanjutnya sampel sebanyak 2 gram ditimbang dalam cawan dan dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC selama 3 jam atau sampai beratnya konstan. Cawan beserta isinya kemudian didinginkan sampai suhu ruang dalam desikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Perhitungan kadar air dapat dilihat sebagai berikut:
Kadar air (%) = −
−
� %
Analisis morfometrik
Baby fish nila 2,3,4 minggu
4
Keterangan :
A = berat cawan kosong (gram)
B = berat cawan + sampel awal (gram) C = berat cawan + sampel kering (gram) 2) Analisis kadar abu (SNI 1992-01-2891)
Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama satu jam pada suhu 105.oC, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel yang telah ditimbang sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 1 jam, selanjutnya dimasukkan ke dalam desikator hingga suhu ruang, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar abu ditentukan dengan rumus:
Kadar abu (%) = −
−
� %
Keterangan :
A = berat cawan porselen kosong (gram) B = berat cawan dengan sampel (gram)
C = berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram) 3) Analisis kadar protein (SNI 1992-01-2891)
Tahap analisis protein terdiri dari tiga, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikrokjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 100 mL, lalu ditambah 0,25 gram selenium dan 3 mL H2SO4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu kjeldahl ditambahkan 50 mL akuades dan 20 mL NaOH 40%, kemudian didestilasi dengan suhu destilator 100oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 mL yang berisi campuran 10 mL asam borat (H3BO3) 2% dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 mL dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Destilat lalu dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Dengan metode ini diperoleh kadar nitrogen total yang dihitung. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut:
%N = (S-B)x NHCL x 14 x 100 % w x 1000
Keterangan:
S = Volume titran sampel (mL) B = Volume titran blanko (mL) W = Bobot sampel kering (mg)
% Kadar Protein: % Nitrogen x faktor konversi
Keterangan : Protein mengandung rata-rata 16 % nitrogen. Faktor konversi = 100 %
4) Kadar lemak (SNI 1992-01-2891)
Sebanyak 2 gram sampel disebar di atas kapas yang beralas kertas saring dan digulung membentuk thimble, kemudian dimasukkan ke dalam labu soxhlet. Sampel diekstraksi selama 6 jam dengan pelarut lemak berupa heksan sebanyak 150 mL. Lemak yang terekstrak dikeringkan dalam oven pada suhu 100 oC selama 1 jam. Kadar lemak dihitung dengan rumus:
Kadar lemak = Bobot lemak terekstrak x 100 % Bobot sampel
Analisis Asam Amino (AOAC 2005 dengan modifikasi)
Komposisi asam amino ditentukan menggunakan HPLC. Langkah pertama yang dilakukan adalah membilas perangkat HPLC dengan eluen berupa buffer Na-asetat pH 6,5 dan metanol 95% selama 2-3 jam. Syringe yang akan digunakan juga dibilas dengan akuades. Analisis asam amino dengan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu (1) tahap pembuatan hidrolisat protein; (2) tahap pengeringan; (3) tahap derivatisasi; dan (4) tahap injeksi serta analisis asam amino.
1) Tahap pembuatan hidrolisat protein
Sampel pertama-tama ditimbang sebanyak 30 mg kemudian dihancurkan. Sampel yang telah hancur dihidrolisis asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 2 mL yang kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 110 °C selama 24 jam.
2) Tahap pengeringan
Sampel yang telah dihidrolisis pada suhu kamar dipindahkan isinya ke dalam labu evaporator 50 mL, dibilas dengan 2 mL HCl 0,01 N. Sampel dan cairan bilasan kemudian disaring dengan kaca masir ukuran 2 dan dimasukkan ke dalam labu evaporator. Proses tersebut diulangi 2-3 kali. Sampel selanjutnya dikeringkan menggunakan rotary evaporator selama 15-30 menit pada suhu 70 °C. Sampel yang sudah kering ditambah dengan 5 mL HCl 0,01 N kemudian disaring dengan mikrofilter berukuran 0,45 µm.
3) Tahap derivatisasi
Larutan derivatisasi dibuat dengan menambahkan buffer kalium borat 1 M pH 10,4 pada sampel dengan perbandingan 1:1. Sebanyak 50 μL larutan derivatisasi dimasukkan ke dalam vial kosong yang bersih kemudian ditambah 250 μL pereaksi phthaldialdehid. Larutan pereaksi phthaldialdehid dibuat dengan cara melarutkan 50 mg phthaldialdehid ke dalam 4 mL metanol absolut, kemudian ditambah dengan 0,025 mL merkaptoetanol, larutan brij 30% sebanyak 0,050 mL dan buffer kalium borat 1 M pH 10,4 sebanyak 1 mL.
4) Injeksi ke HPLC
Larutan diinjeksikan sebanyak 5 μL ke dalam HPLC. Pemisahan asam amino dilakukan selama ±30 menit. Perhitungan konsentrasi asam amino yang ada pada bahan dilakukan dengan pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Kandungan asam amino dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus :
µmol asam amino = luas area sampel
luas area standar x C x FP
6
FP = Faktor pengenceran (5 mL)
% asam amino = µmol asam amino x Mr asam amino
mg sampel x 100%
Kondisi alat HPLC saat dilakukannya analisis asam amino adalah sebagai berikut:
Temperatur : 27°C (suhu ruang)
Jenis kolom HPLC : Ultra techspere (Coloumb C-18) Kecepatan alir eluen : 1 mL/menit
Tekanan : 3000 psi
Fase gerak : Buffer Na-asetat dan metanol 95% Detektor : Fluoresensi
Panjang gelombang : 254 nm Analisis Histologis (Angka et al. 1990)
Pengamatan jaringan daging baby fish ikan nila diawali dengan pembuatan preparat dengan metode parafin. Tahap pembuatan preparat meliputi fiksasi, dehidrasi, clearing, impregnasi, embedding, blocking, trimming, pemotongan jaringan, pewarnaan, serta perekatan jaringan menggunakan mounting agent.
Fiksasi dilakukan dalam larutan BNF (Buffer Normal Formalin) selama lebih dari 36 jam, larutan fiksasi dibuang dan didehidrasi melalui perendaman sampel dalam alkohol bertingkat pada suhu ruang dengan alkohol 70% selama 24 jam, 80% selama 2 jam, 90% selama 2 jam, 95% selama 2 jam, 95% selama 2 jam, 95% selama 2 jam, 100% selama 12 jam.
Proses clearing dimulai dari perendaman sampel dalam clearing agent. Sampel direndam dalam alkohol:xilol (1:1) selama 30 menit yang dilanjutkan dengan tahap impregnasi dan embedding. Tahap Impregnasi adalah perendaman sampel ke dalam xilol:parafin (1:1) dalam gelas piala selama 45 menit. Embedding
adalah perendaman sampel di dalam parafin cair selama 45 menit. Kedua proses ini berlangsung di dalam oven pada suhu 60 oC.
Sampel yang telah dilakukan embedding dalam parafin cair lalu di blok (dicetak) dengan parafin cair yang kemudian dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku, misalnya kertas kalender, dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit membeku. Sampel kemudian disusun dalam cetakan dan dituangi parafin cair hingga terendam, serta dibiarkan membeku dalam suhu ruang selama 24 jam. Setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin dikeluarkan dari cetakan lalu dilakukan trimming
menggunakan silet.
Jaringan dipotong dengan mikrotom putar setebal 4 μm dan pita-pita parafin direkatkan pada gelas obyek. Proses pewarnaan dilakukan menggunakan hematoksilin dan eosin. Pewarnaan diawali dengan perendamaan gelas obyek ke dalam xilol I dan xilol II masing-masing selama 2 menit, dilanjutkan perendaman dalam alkohol absolut (100%), 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50% masing-masing selama 2 menit. Obyek dibilas dengan akuades selama 2 menit. Kemudian obyek dimasukkan ke dalam pewarna hematoksilin selama 7 menit dan dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang tidak diserap. Obyek
direndam kembali dalam pewarna eosin selama 3 menit dan dicuci kembali dengan akuades. Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 50%, 70%, 85%, 90%, 100%, 100%, xilol I, xilol II masing-masing selama 2 menit.
Proses selanjutnya adalah penutupan gelas obyek dengan pemberian
mounting agent atau Canada Balsam pada gelas obyek, kemudian dikeringkan selama 24 jam. Pengamatan preparat awetan dilakukan dengan mikroskop cahaya
Olympus CX41 dengan perbesaran hingga 400x. Proses pengambilan gambar dilakukan dengan kamera Olympus DP21. Diagram alir pembuatan preparat dengan metode parafin, pewarnaan dan pengamatan disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2 Diagram alir pembuatan preparat metode parafin
Baby fish nila 2,3,4 minggu
Fiksasi dengan BNF 10% selama 24 jam
Dehidrasi dengan alkohol bertingkat dan Penjernihan alkohol:xilol (1:1)
Impregnasi xilol:parafin (1:1) dan
Embedding pada suhu 60oC
Trimming dengan silet Pemotongan dengan mikrotom
Perekatan pita parafin
Pewarnaan dengan hematoksilin dan eosin
Penutupan gelas obyek dengan mounting agent
Pengamatan mikroskop Pemotretan
8
Analisis Data Proksimat dan Asam Amino
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial dengan satu faktor yaitu perbedaan umur panen sebagai faktor perlakuan, dengan tiga kali ulangan. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan analisis data Anova microsoft excel dan perangkat lunak Statistical Package for Social Science (SPSS). Model matematika rancangan acak lengkap pola faktorial menurut Stell dan Torrie (1995) adalah sebagai berikut:
Yijk = μ + αi + εi Keterangan :
Yijk = nilai pengamatan pada satuan percobaan ke-k (k= 1, 2) yang memperoleh kombinasi perlakuan faktor α (frekuensi pencucian) taraf ke-i (i= 1, 2). μ = nilai tengah populasi.
αi = pengaruh faktor umur panen ( 2 minggu, 3 minggu, 4 minggu). εi = pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k pada perlakuan i.