3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2019 hingga Juni 2020 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Medan.
3.2 Peremajaan Jamur Endofit
Isolat jamur endofit yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat yang berasal dari beberapa jenis rhizom tumbuhan suku Zingiberaceae (Lampiran 1).
Isolat jamur yang digunakan adalah sebanyak 31 jenis. Jamur endofit diremajakan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) steril, lalu diinkubasi selama 3 hingga 5 hari pada suhu ±28°C.
3.3 Skrining Aktivitas Kitinase
Kultur jamur endofit yang sudah diremajakan diinokulasikan pada medium garam minimum kitin (MGMK) agar (Komposisi medium di lampiran 2) sebanyak satu cork borer dan diletakkan di tengah permukaan medium. Kultur jamur endofit diinkubasi pada suhu ±28°C selama 7 hari. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat adanya zona bening yang terbentuk dan diukur diameter koloni jamur yang tumbuh pada medium menggunakan jangka sorong. Terbentuknya zona bening mengindikasikan bahwa isolat jamur endofit memiliki aktivitas kitinase. Selanjutnya, jamur endofit yang memiliki zona bening dipilih untuk dilakukan uji selanjutnya.
3.4 Produksi Kitinase Jamur Endofit Kitinolitik
Dari hasil uji skrining sebelumnya, diperoleh sebanyak 2 isolat jamur endofit yang mampu menghasilkan zona bening dari 31 jenis jamur yang sudah diujikan.
Produksi kitinase dilakukan dengan cara meremajakan isolat jamur endofit terlebih dahulu. Isolat jamur endofit yang sudah berumur 3 hari diinokulasikan sebanyak 5
13
cork borer ke dalam 100 ml medium garam minimum kitin (MGMK) cair pada erlenmeyer 250 ml. Kultur diinkubasi di atas orbital shaker pada kecepatan 120 rpm selama 7 hari pada suhu ±28°C. Setiap sehari sekali diambil kultur sebanyak 10 ml dalam erlenmeyer yang sama, lalu disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C untuk memperoleh supernatan. Supernatan yang terbentuk diukur aktivitasnya.
3.5 Pengukuran Aktivitas Kitinase Jamur Endofit Kitinolitik
Pengukuran aktivitas kitinase dilakukan dengan metode Monreal dan Reese (1969) yang telah dimodifikasi. Aktivitas kitinase ditentukan berdasarkan jumlah gula reduksi (N-asetil-D-Glukosamin) yang dilepas dan diukur secara kolorimetri.
Pengukuran diawali dengan membuat kurva standar N-asetil-D-Glukosamin dengan rangkaian konsentrasi (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ppm) dalam 3,5-Dinitrosalicyclic acid (DNS) dan akuades. Campuran dihomogenkan dan dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit. Selanjutnya, campuran didinginkan dan diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
Pengujian enzim dilakukan dengan mereaksikan enzim pada tabung reaksi yang terdiri dari perlakuan sampel, kontrol dan blanko. Reaksi perlakuan sampel dilakukan dengan mencampurkan 2 ml supernatan dengan 2 ml buffer fosfat pH 7 dan 2 ml koloidal kitin 0,3%. Sedangkan kontrol dibuat dengan reaksi yang sama tanpa penambahan supernatan. Blanko dibuat dengan mencampurkan 2 ml akuades dan 1 ml DNS. Kemudian masing-masing perlakuan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit di dalam inkubator shaker dengan kecepatan 120 rpm. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 1 ml DNS dan dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit. Selanjutnya, nilai absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS mini (Shimadzu) pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke dalam persamaan regresi kurva standar untuk mengetahui konsentrasi enzim.
14
3.6 Pengukuran Kadar Protein
Pengukuran kadar protein enzim dilakukan berdasarkan metode Bradford (1976) dan menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Pengukuran diawali dengan pembuatan kurva standar dengan rangkaian konsentrasi (0, 20, 40, 60, 80 dan 100 ppm) dalam akuades dan reagen Bradford. Larutan kemudian dihomogenkan dan diukur niali absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm.
Pengukuran dilakukan dengan mencampurkan 1 ml enzim dengan 3 ml reagen Bradford, lalu dihomogenkan dan diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-VIS mini (Shimadzu) pada panjang gelombang 595 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke dalam persamaan regresi kurva standar untuk mengetahui kadar konsentrasi protein enzim.
3.7 Karakterisasi pH
Pengujian ini dilakukan dengan mereaksikan 2 ml enzim dengan 2 ml koloidal kitin 0,3% dan 2 ml larutan penyangga pada pH 4 hingga 9. Buffer asetat digunakan pada rentang pH 4-5, buffer fosfat digunakan pada rentang pH 6-7 dan buffer Tris-HCl pada pH 8-9. Konsentrasi masing-masing buffer adalah 50 mM.
Selanjutnya, campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Lalu, disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. Sebanyak 2 ml supernatan yang terbentuk direaksikan dengan 1 ml DNS, lalu dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit untuk menghentikan reaksi. Nilai absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS mini (Shimadzu) pada panjang gelombang 540 nm. Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui pH optimum kitinase yang akan digunakan untuk uji selanjutnya.
3.8 Karakterisasi Ion Logam
Pengujian ini dilakukan dengan mereaksikan 2 ml enzim, 2 ml buffer fosfat pH 6, koloidal kitin 0,3% dan 0,1 ml larutan ion logam dalam bentuk garam yaitu MnCl2, CaCl2, KCl, CuSO4, NaCl, MgCl2, ZnCl2, FeSO4, Pb(NO3)2. Konsentrasi masing-masing larutan ion logam adalah 1 mM. Selanjutnya, campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Lalu, disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. Sebanyak 2 ml
15
supernatan yang terbentuk direaksikan dengan 1 ml DNS, lalu dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit untuk menghentikan reaksi. Nilai absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS mini (Shimadzu) pada panjang gelombang 540 nm.
3.9 Uji Antagonis Jamur Endofit Kitinolitik dengan Jamur Patogen
Jamur patogen yang digunakan pada uji ini adalah Ganoderma boninense dan Fusarium oxysporum yang diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Jamur patogen terlebih dahulu ditumbuhkan pada media PDA untuk memperoleh miselium segar. Miselium jamur patogen diambil menggunakan cork borer dan diletakkan di tengah permukaan MGMK agar. Setelah tiga hari inkubasi, blok jamur endofit dimasukkan ke kedua sisi jamur patogen dengan jarak yang sama. Selanjutnya, diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang. Persentase hambatan miselium yang terbentuk diukur dengan rumus (Bivi et al., 2010):
CGI (%) = (R1 − R2)
R1 × 100
Ket:
CGI = Colony Growth Inhibition (hambatan pertumbuhan miselium ) R1 = Jari-jari jamur patogen yang berlawanan arah dengan jamur endofit R2 = Jari-jari koloni jamur patogen menuju jamur endofit
3.10 Pengendapan Amonium Sulfat Ekstrak Kasar Kitinase
Pengujian dilakukan menggunakan jenis jamur patogen yang sama dengan uji sebelumnya. Ekstrak kasar kitinase sebelumnya dipresipitasi menggunakan garam amonium sulfat dengan kejenuhan 70% pada suhu 10°C. Amonium sulfat ditambahkan ke dalam supernatan sedikit demi sedikit sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 1 jam. Hasil presipitasi selanjutnya disimpan pada suhu 4°C selama 24 jam, lalu disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. Pelet yang terbentuk dilarutkan dalam buffer fosfat pH 7 sebanyak 2 ml.
Ekstrak kasar kitinase yang dihasilkan akan diujikan kemampuan daya hambatnya terhadap jamur patogen tanaman dengan menggunakan kertas cakram.
16
3.11 Uji Kemampuan Daya Hambat Ekstrak Kasar Kitinase terhadap Jamur Patogen
Uji antagonis dilakukan dengan menginokulasikan jamur patogen menggunakan cork borer, lalu diletakkan di tengah permukaan media MGMK agar.
Setelah 3 hari inkubasi, sebanyak 10 μl kitinase hasil presipitasi diinokulasikan pada kertas cakram di bagian kanan dan kiri jamur patogen dengan jarak 3,5 cm. Biakan diinkubasi pada suhu ±28°C selama 5 hari. Aktivitas penghambatan ditentukan berdasarkan zona hambat yang terbentuk Persentase hambatan miselium yang terbentuk dihitung dengan rumus Bivi et al. (2010).
BAB 4