1. Pengukuran Kadar Oksigen Terlarut di dalam Botol
Pengukuran kadar oksigen terlarut di dalam botol dilakukan oleh bagian Quality Control produsen R&K Beverages. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat Orbhiphene Analyzer atau lebih dikenal dengan Oxygen Meter yang menggunakan sistem komputerisasi. Perlakuan botol yang diukur kadar oksigen terlarutnya, antara lain pada posisi dibuka terus-menerus, dimiringkan, dan dibuka lalu ditutup kembali. Pengukuran dilakukan nonstop secara otomatis setiap 2 jam selama 24 jam.
2. Pemberian Air Minum Penambah Oksigen kepada Responden
Objek penelitian utama ini adalah air minum biasa dan air minum penambah oksigen. Sedangkan subjek penelitian adalah manusia yang merupakan mahasiswa Departemen ITP, IPB (dalam hal ini sel darah manusia). Responden tersebut berjumlah 25 orang, yang terdiri dari 15 orang laki-laki dan 10 orang perempuan berusia antara 21-23 tahun. Responden tersebut kemudian dibagi menjadi 3 kelompok dengan perlakuan yang berbeda-beda. Kelompok 1 yang terdiri dari 8 orang, mengkonsumsi air minum penambah oksigen 10 ppm. Kelompok 2 terdiri dari 7 orang yang mengkonsumsi air minum penambah oksigen 80 ppm. Dan yang terakhir kelompok 3 terdiri dari 10 orang, mengkonsumsi air minum penambah oksigen 130 ppm.
Sebelum pelaksanaan intervensi, masing-masing mahasiswa diperiksa kesehatannya terlebih dahulu secara klinis oleh dokter umum. Setelah dipastikan sehat dan bebas infeksi, mahasiswa tersebut diperbolehkan menjadi responden untuk penelitian ini. Responden diminta
untuk menandatangani MoU (Memorandum of Understanding) yang menyatakan bahwa responden bersedia melakukan kewajiban yang diminta selama penelitian berlangsung. Beberapa hal yang tercantum dalam MoU tersebut, antara lain jaminan keamanan air minum sebagai objek penelitian utama. Di samping itu juga berisi pernyataan kesediaan responden untuk melaksanakan segala ketentuan yang diberlakukan kepada responden sampai dengan proses pengambilan darah setelah intervensi selesai, yaitu selama 12 hari.
Intervensi sampel dilakukan kepada semua responden pada masing-masing kelompok. Intervensi dilakukan dengan cara mengkonsumsi sampel air minum penambah oksigen sebanyak dua kali sehari, yaitu setelah sarapan dan makan siang selama 12 hari. Setiap konsumsi, responden diharuskan untuk menghabiskan satu botol sampel air minum penambah oksigen yang berisi sebanyak 385 ml. Responden penelitian ini merupakan mahasiswa Departemen ITP yang sedang melakukan penelitian sebagai tugas akhir di kampus IPB, oleh karena itu pelaksanaan intervensi sampel air minum penambah oksigen untuk masing-masing kelompok dilakukan di lingkungan kampus. Sampel air minum diberi kode tertentu sehingga tiap-tiap responden tidak mengetahui jenis sampel yang diminumnya (blind sample). Air minum tersebut harus dihabiskan sekaligus pada waktu itu juga tanpa bersisa sedikitpun untuk memastikan oksigen terlarut yang masuk bersamaan dengan air minum.
3. Proses Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan dua kali, yaitu sebelum dan sesudah intervensi (pemberian sampel air minum). Proses tersebut dilaksanakan di laboratorium klinik Caritas, Bogor oleh tenaga medis yang ahli dan berpengalaman.
Darah diambil secara steril dari masing-masing responden dengan menggunakan syringe 20 ml yang telah mengandung larutan EDTA 1% yang berfungsi sebagai antikoagulan. Kemudian darah tersebut digunakan
untuk penelitian lebih lanjut, yaitu isolasi dan proliferasi limfosit dengan menggunakan metode pewarnaan MTT.
4. Persiapan Ruang Kerja dan Laminar Flow Cabinet Steril
Sebelum melakukan kerja steril, ruangan dan laminar flow cabinet disterilkan terlebih dahulu. Ruang kerja disterilkan dengan proses pengasapan KMNO4. Sebelum dilakukan pengasapan, dipastikan ruangan tertutup rapat dan tidak ada celah yang kontak langsung dengan udara luar.
Ruangan diasapi dengan menggunakan KMNO4 bubuk sebanyak 167 gram dan larutan formaldehida 40% sebanyak 1000 ml yang ditempatkan ke dalam wadah lalu dipanaskan sampai terbentuk asap dan didiamkan selama 3 hari tanpa dimasuki oleh siapapun. Proses ini dilakukan untuk mengilangkan kontaminan bakteri dan virus yang berada di udara dalam ruangan yang dapat mengkontaminasi aktivitas penanganan sel limfosit di dalam ruang kerja.
Pensterilan laminar flow cabinet dilakukan dengan cara penyinaran sinar UV selama 15 menit setiap akan digunakan dan juga penyemprotan alkohol 70% pada permukaan meja laminar flow cabinet. Hal tersebut juga berlaku untuk peralatan yang akan digunakan selama pengerjaan isolasi dan proliferasi limfosit di dalam laminar flow cabinet. Cara menjaga kesterilanlaminar flow cabinet adalah dengan mengaliri udara laminar di dalamnya untuk mencegah kontaminasi dengan udara luar.
5. Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media Kultur Sel (Mosmann, 1983) Pembuatan media dan tahap-tahap selanjutnya dalam analisis limfosit dilakukan di dalam laminar flow cabinet yang steril dan dialiri oleh udara laminar. Sebelum digunakan, ruangan dan peralatan disinari terlebih dahulu dengan sinar UV selama 15 menit.
a. Persiapan Media Kultur Sel Limfosit
Media yang digunakan untuk kultur dan pemeliharaan sel limfosit berupa 10.42 gram RPMI-1640 bubuk yang telah mengandung
L-glutamin. Bubuk tersebut dilarutkan dengan aquabidest steril sehingga diperoleh 1 liter larutan RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 gram NaHCO3 dan 1% antibiotik gentamisin. Larutan yang sudah bercampur disterilisasi dengan membran filter 0.2 μm steril, maka didapatkan larutan RPMI-1640 steril yang digunakan untuk isolasi sel limfosit. Untuk media pertumbuhan dan pemeliharaan sel limfosit digunakan media larutan RPMI-1640 di atas dengan penambahan fetal bovine serum (FBS) 10% steril.
b. Pembuatan Larutan MTT 0.5 %
Sebesar 0.05 gram garam MTT bubuk dicampurkan dengan PBS sebanyak 10 ml. Kemudian larutan pewarna liquid yang telah homogen tersebut disterilkan dengan melewatkan larutan MTT ke dalam membran fiter steril berukuran 0.2 μm.
c. Pembuatan Larutan Phosphate Buffer Saline (PBS)
Satu sachet PBS bubuk dengan pH 7.4 dilarutkan dalam 1 liter aquabidest. Setelah itu, larutan PBS dilewatkan melalui membran steril berukuran 0.2 μm sehingga didapatkan larutan yang steril. Komposisi PBS terdiri dari NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4, serta Na2HPO4.2H2O.
d. Pembuatan Larutan HCl-Isopropanol 0.04 N
Sebanyak 23.4 μm HCl pekat (37% p.a) dipipet dan ditambahkan dengan isopropanol p.a 8.9766 ml. Setelah itu larutan diaduk sampai homogen dan siap digunakan. Larutan ini baru dibuat jika akan digunakan saja dan tidak dapat disimpan.
Pewarna tryphan blue bubuk sebanyak 0.05 gram dilarutkan dengan 20 ml PBS. Setelah diaduk sampai homogen, larutan pewarna tersebut dilewatkan melalui membran filter steril 0.2 μm.
6. Pengujian Proliferasi Sel Limfosit a. Isolasi Limfosit (Fisher et al., 1998)
Darah dari dalam syringe dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Bagian tengah (lapisan buffycoat) yang berisi sel-sel limfosit diambil perlahan-lahan dengan pipet pasteur kemudian ditambahkan 3 ml media RPMI-1640.
Histopaque dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian diletakkan perlahan-lahan campuran lapisan buffycoat dan media RPMI-1640 di atasnya dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit. Hasil sentrifuse didapatkan lapisan putih seperti cincin antara histopaque dan RPMI-1640.
Lapisan putih diambil dengan pipet pasteur ke dalam tabung ssntrifuse dan ditambahkan 5 ml RPMI-1640, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, lalu pada bagian pelet ditambahkan RPMI-1640 dan disentrifuse kembali dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Pencucian limfosit ini dilakukan dua kali sehingga diperoleh kemurnian suspensi sel limfosit yang tinggi.
b. Penghitungan Sel Limfosit (Fisher et al., 1998)
Sebelum dilakukan kultur sel limfosit, terlebih dahulu dilakukan penghitungan sel limfosit secara manual dengan menggunakan pewarna tryphan blue. Sebanyak 50 μl suspensi sel limfosit ditempatkan ke dalam sumur microplate dan ditambahkan 50 μl tryphan blue ke dalamnya. Penghitungan sel limfosit dilakukan dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali.
Jumlah sel limfosit yang dapat dihitung harus lebih besar dari 95% berupa sel limfosit hidup yang berwarna terang. Limfosit yang diperoleh akan digunakan untuk analisis proliferasi sel B dan sel T. Penghitungan sel limfosit dengan hemasitometer dapat dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
N = A x FP x 104 sel/ml
Keterangan : N = jumlah sel limfosit/ml
A = jumlah sel hidup rata-rata per kotak 0.1 mm3 FP = faktor pengenceran
c. Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT (Mosmann, 1983) Jumlah sel limfosit dari masing-masing responden ditepatkan menjadi 2 x 106 sel/ml dengan media sintetik RPMI-1640. Ke dalam tiap sumur microplate dimasukkan 100 μl suspensi sel dari masing-masing responden. Kemudian ditambahkan masing-masing-masing-masing ke dalam sumur, 80 μl larutan mitogen Concanavalin A 25 μg/ml untuk pengujian proliferasi sel T atau 80 μl larutan mitogen LPS Salmonella Typhosa 25 μg/ml untuk pengujian proliferasi sel B, sehingga diperoleh konsentrasi dalam kultur 10 μg/ml konsentrasi Con A dan LPS di tiap-tiap sumur. Sebagai kontrol hanya ditambahkan 80 μl media RPMI-1640, tanpa penambahan mitogen. Selanjutnya ditambahkan ke masing-masing sumur 20 μl FBS sehingga volume total tiap sumur berisi 200 μl kultur. Kultur diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator bersuhu 37oC dengan kandungan atmosfer yang mengandung 5% CO2 dan RH 95%.
Pengujian aktivitas proliferasi sel limfosit ini dilakukan dengan menggunakan metode MTT. Sebelum masa inkubasi berakhir, 6 jam sebelumnya, ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 10 μl MTT dengan konsentrasi 0.5% dan diinkubasi kembali pada kondisi yang sama selama 6 jam. Pada akhir masa inkubasi, ditambahkan 80 μl HCl-isopropanol 0.04 N, setelah itu dilakukan pembacaan sel dengan alat
microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai indeks stimulasi (IS) dapat dihitung dengan persamaan seperti berikut ini :
IS = kontrol sel OD mitogen perlakuan sel OD 7. Analisis Statistik
Pengujian penelitian konsumsi air minum penambah oksigen ini dilakukan dengan membandingkan nilai indeks stimulasi (IS) proliferasi sel limfosit B dan T setelah intervensi (IS akhir) dan sebelum intervensi (IS awal). Pengujian ini dilakukan pada responden kelompok 1 (10 ppm), 2 (80 ppm), dan kelompok 3 (130 ppm). Pengukuran nilai IS awal adalah sebelum intervensi dan pengukuran nilai IS akhir 12 hari setelah intervensi pada responden manusia. Analisis statistik terhadap nilai IS sebelum dan sesudah menggunakan analisis sidik ragam Paired Sample T-Test untuk menentukan perbedaan nyata pada taraf uji 5%.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN