3 METODOLOGI
3.3 Metode Penelitian
Metode penelitian yang dilakukan terdiri atas dua tahap, yaitu (1) penapisan senyawa antibakteri dari tiga isolat BAL, yakni SK(15), SK(16) dan SK(19) dan (2) produksi senyawa antibakteri dari isolat BAL terpilih. Tahap pertama bertujuan untuk menyeleksi isolat BAL yang menghasilkan senyawa antibakteri terbaik. Tahapan ini meliputi kultivasi, pemanenan dan uji aktivitas
17
senyawa antibakteri. Tahap kedua bertujuan untuk menentukan waktu optimum produksi senyawa antibakteri dari isolat terpilih. Tahap ini meliputi kultivasi isolat terpilih, pengukuran kadar asam laktat dan uji aktivitas senyawa antibakteri dari isolat terpilih.
3.3.1 Kultivasi
Tahap awal kultivasi dilakukan dengan mempersiapkan media pertumbuhan untuk bakteri asam laktat (BAL). Refresh isolat BAL atau proses peremajaan biakan dilakukan dengan menggoreskan isolat BAL dari gliserol ke media MRSA miring dan diinkubasi pada keadaan semi anaerob dengan suhu 37oC selama 48 jam. Pembuatan inokulum dilakukan dengan mengambil 1 ose BAL dari MRSA miring kemudian diinokulasikan dalam 10 ml MRSB. Setelah itu diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37oC selama 18 jam hingga OD660 inokulum mencapai 0,6-0,8.
Sebanyak 10% inokulum diinokulasikan dalam medium produksi (MRSB) dengan volume kerja 90 ml dalam botol schott. Kemudian media MRSB tersebut diinkubasi dengan water bath shaker pada suhu 37oC selama 24 jam. Pegamatan yang dilakukan adalah pengukuran pH dan OD awal (sebelum inkubasi dengan
shaker water bath) dan pengukuran pH dan OD akhir (setelah diinkubasi selama 24 jam).
3.3.2 Pemanenan
Setelah kultur diinkubasi selama 24 jam dilakukan tahap pemanenan. Kultur disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4oC selama 15 menit. Proses sentrifugasi akan menghasilkan pemisahan antara supernatan dan biomassa. Supernatan tersebut kemudian diberi tiga perlakuan, yaitu (1) tanpa dinetralkan, (2) dinetralkan dengan NaOH 1 N dan (3) dinetralkan kemudian diendapkan dengan (NH4)2SO4 sebesar 50%. Tahap purifikasi parsial bakteriosin (presipitasi protein) ini akan menghasilkan ekstrak endapan (Purwanti 2003). Kemudian supernatan dengan perlakuan (1) dan (2) difiltrasi dengan menggunakan milipore filter dengan ukuran pori 0,2 µm sehingga diperoleh supernatan bebas sel. Supernatan pada perlakuan (3) diendapkan selama 24 jam dalam refrigerator. Supernatan tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4oC selama 30 menit. Kemudian endapan
yang diperoleh dilarutkan dengan larutan buffer fosfat 0,1 M dengan pH 7 (Lampiran 1). Penambahan substrat kasar bakteriosin dengan buffer fosfat bertujuan agar mengurangi bahan pengekstrak yang terikat pada molekul protein (Wijaya 2002 diacu dalam Magdalena 2009).
3.3.3 Uji aktivitas senyawa antibakteri
Isolat bakteri uji berupa Listeria monocytogenes, Escherichia coli dan
Salmonella typhimurium disegarkan kembali dalam media NA miring selama 18.jam. Kemudian bakteri indikator diinokulasi dalam 10 ml NB dan diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37oC selama 18 jam. Sebanyak 20 µl bakteri uji dengan OD 0,6-0,8 dipindahkan ke dalam 20 ml media MHA cair dengan suhu media 40oC. Campuran media MHA cair dan bakteri uji dituangkan ke dalam cawan petri steril. Uji potensi senyawa antibakteri dari bakteri asam laktat dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur agar (agar well diffusion). Media agar yang telah padat dibuat sumur dengan menggunakan pipet Pasteur steril berdiameter 5 mm. Kemudian sebanyak 50 µl supernatan steril dimasukkan ke dalam masing-masing sumur yang telah dibuat, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kemudian dilakukan pengukuran diameter zona bening pada masing-masing bakteri indikator. Zona bening yang dihasilkan di sekeliling sumur menunjukkan adanya daya hambat. Areal penghambatan diukur berdasarkan diameter areal bening yang terbentuk di sekitar sumur (Hilmi dan Yusuf 2000 diacu dalam Nurmalis 2008). Diagram alir penapisan senyawa antibakteri dari tiga isolat BAL yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 2.
19
Gambar 2 Diagram alir penapisan senyawa antibakteri dari tiga isolat BAL yang berbeda. Sentifugasi 10.000 rpm suhu 4oC; 30 menit Filtrasi dengan millipore filter Filtrasi dengan millipore filter Tidak dinetralkan
Dinetralkan dengan NaOH dan diendapkan dengan
(NH4)2SO4 50% Dinetralkan dengan NaOH Supernatan aktif asam (A) Supernatan aktif setelah dinetralkan (N) Endapan ditambahkan larutan buffer fosfat
Supernatan aktif hasil pengendapan (E) Uji aktivitas senyawa
antibakteri
Kultur disentifugasi 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit
Biomassa Supernatan Kultivasi dalam 90 ml MRSB, shaker
pada suhu 37oC selama 24 jam; ukur OD dan pH (awal dan akhir kultivasi)
Refresh isolat BAL dalam MRSA, inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam
Isolat BAL
Inokulasi dalam 10 ml MRSB,
3.3.4 Kultivasi isolat terpilih
Tahap awal produksi senyawa antibakteri dari isolat BAL terpilih dilakukan dengan melakukan refresh isolat BAL terpilih atau proses peremajaan biakan. Proses ini dilakukan dengan menggoreskan isolat BAL dari gliserol ke media MRSA miring dan diinkubasi pada keadaan semi anaerob dengan suhu 37oC selama 48 jam. Kemudian dilakukan pembuatan inokulum dengan mengambil 1 ose BAL dari MRSA miring dan diinokulasikan dalam 30 ml MRSB. Setelah itu diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37oC selama 18 jam hingga OD660 inokulum mencapai 0,6-0,8.
Sebanyak 10% inokulum diinokulasikan dalam 22 buah tabung ulir berisi medium produksi (MRSB) dengan volume kerja 12 ml. Kemudian media MRSB tersebut diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37oC. Pegamatan yang dilakukan adalah pengukuran pH dan OD per 4 jam selama 48 jam. Kultur yang telah diamati tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4oC selama 15 menit. Proses sentrifugasi akan menghasilkan supernatan. Supernatan tersebut kemudian difiltrasi dengan menggunakan millipore filter
berukuran pori 0,2 µm.
3.3.5 Pengukuran kadar asam laktat
Kadar asam laktat pada supernatan BAL diuji dengan metode analisis total asam tertitrasi. Dalam penentuan kadar asam laktat digunakan larutan baku standar NaOH 0,1091 N dari indikator fenolftalein. Masing-masing supernatan dilarutkan dengan pewarna fenolftalein, kemudian dititrasi dengan menggunakan NaOH hingga warna larutan supernatan berubah menjadi kemerahan. Adanya aktivitas bakteri asam laktat selama proses produksi memungkinkan kandungan asam laktatnya meningkat. Adapun pengukuran kadar asam laktat dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
% Asam laktat = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100% Bobot Sampel
Keterangan:
V NaOH : Volume NaOH yang terpakai (ml)
N NaOH : Normalitas NaOH yang terukur (0,1091 N) FP : Faktor Pengencer (1)
21
3.3.6 Uji aktivitas senyawa antibakteri dari isolat terpilih
Uji aktivitas senyawa antibakteri dari isolat terpilih dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur agar (agar well diffusion), sama halnya dengan pengujian pada tahap penapisan senyawa antibakteri. Namun, terdapat empat bakteri yang diujikan, yaitu Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium. Pengukuran diameter zona bening dilakukan per waktu produksi pada masing-masing bakteri uji. Diagram alir produksi senyawa antibakteri dari isolat terpilih dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Diagram alir produksi senyawa antibakteri dari isolat terpilih.
Refresh isolat BAL dalam MRSA, inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam
Isolat BAL
Kultivasi dalam MRSB, shaker pada suhu 37oC selama 24 jam; ukur OD dan
pH per 4 jam selama 48 jam Inokulasi dalam 30 ml MRSB, shaker pada suhu 37oC selama 18 jam
Kultur disentifugasi 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit
Biomassa Supernatan
Pengukuran kadar asam laktat
Uji aktivitas senyawa antibakteri
Penapisan antibakteri perlu dilakukan untuk mengetahui potensi senyawa antibakteri dari bakteri asam laktat dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Daya hambat suatu senyawa antibakteri dapat diketahui dengan melakukan uji aktivitas menggunakan metode difusi sumur agar. Metode ini sering digunakan sebagai bioassay untuk penentuan jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan. Aktivitas hambatan terhadap pertumbuhan bakteri patogen yang diujikan tampak sebagai zona bening di sekeliling sumur agar.
