3.1 Waktu dan Lokasi
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai dengan selesai di Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara dan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Teknik Kesehatan Lingkungan Kelas I Medan serta di Laboratorium Terpadu Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini ialah isolat bakteri asam laktat (BAL) asal tambak ikan, Sumatera Utara yang diisolasi oleh Harahap, 2013; Mayasari, 2013; Sitepu, 2013. Bakteri patogen yang digunakan adalah Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella thypimurium. Bahan media tumbuh bakteri yang digunakan adalah media deMan’s Rogosa
Sharpe agar (MRSA), deMan’s Rogosa Sharpe broth (MRSB) dan nutrient agar
(NA), nutrient broth (NB), Muller Hinton agar (MHA), plate count agar (PCA). Bahan-bahan lain yang diperlukan ialah alginat, susu skim, tepung kedelai, inulin,
canola oil, gliserol, CaCl2, phosphate buffer saline (PBS), kertas cakram, larutan NaCl fisiologis 0,85%, alkohol 70% dan akuades steril. Alat-alat yang diperlukan ialah erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, beaker glass, jarum ose, spatula, pinset, syringe, bunsen, hot plate, spektrofotometer, laminar air flow, pH meter, neraca analitik, oven, otoklaf, kulkas, jangka sorong, mesin pengocok, pipet volum, inkubator, gelas ukur, mikropipet, stirrer, dll.
3.3 Rancangan Percobaan
Penelitian dilakukan secara deskriptif dengan 2 kali pengulangan dengan mengumpulkan data BAL potensial dalam menghambat pertumbuhan Salmonella typhimurium, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Enkapsulasi BAL
17
alginat, alginat-susu skim-inulin dan alginat-tepung kedelai-inulin. Karakterisasi bahan enkapsulan yang paling efektif menjaga sel pada ketiga jenis kapsul dilakukan dengan menghitung viabilitas selama penyimpanan pada suhu 4 °C dan 27 °C selama 4 minggu.. Karakterisasi sel bebas dan sel dalam ketiga jenis kapsul juga dilakukan terhadap kondisi asam lambung tiruan dengan variasi pH 2, 3 dan 6 dengan interval 30 menit selama 2 jam dengan menghitung viabilitas sel setelah dimasukkan dalam larutan asam lambung tiruan.
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Persiapan Kultur BAL
Isolat kultur koleksi bakteri asam laktat dari media miring diinokulasikan sebanyak satu ose ke dalam media MRSB kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 °C. Kemudian dilakukan pemeriksaan kemurnian kultur. Pemeriksaan kemurnian kultur BAL potensial dilakukan untuk memastikan kemurnian kultur yang dilakukan melalui pemeriksaan morfologi secara mikroskopik dengan metode pewarnaan Gram dan uji katalase. Metode pewarnaan mengacu pada Fardiaz (1989), yaitu preparat bakteri yang telah dioleskan pada gelas objek, ditetesi dengan kristal violet dan dibilas dengan akuades. Preparat dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin dan kembali dibilas dengan akuades. Preparat kemudian dikering-udarakan, selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin, pembilasan dilakukan dengan auades, preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Metode pengujian katalase mengacu pada McFaddin (1983), uji katalase dilakukan dengan meneteskan larutan H2O2 3% pada kultur muda (umur 24 jam). Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan pemunculan gelembung gas CO2 merupakan hasil positif terhadap pengujian.
3.4.2 Seleksi BAL Potensial Sebagai Kandidat Probiotik
Dalam pengujian isolat potensial BAL digunakan kertas cakram kosong dengan diameter 6 mm. Cakram dimasukkan ke dalam cawan petri kosong steril. Sebanyak 5 isolat kultur cair bakteri BAL dengan kepadatan sel 108 cfu/ml
kemudian dipipet sebanyak 10 µl selanjutnya diteteskan pada permukaan kertas cakram dan ditunggu selama ± 1 jam hingga kultur BAL berdifusi ke dalam cakram. Cakram ini akan digunakan untuk uji antagonis dengan bakteri patogen uji.
Sebanyak 10 ml media MHA masing-masing dituangkan ke dalam petri steril dan dibiarkan memadat. Cotton bud steril dicelupkan ke dalam masing-masing suspensi biakan bakteri patogen Escherichia coli, Staphylococcus aureus
dan Salmonella thypimurium masing-masing dengan kepadatan sel 108 cfu/ml dan diusapkan perlahan-lahan pada permukaan media uji secara merata, selanjutnya dibiarkan mengering pada suhu kamar selama beberapa menit. Dengan menggunakan pinset steril, cakram yang telah ditetesi kultur BAL diletakkan secara teratur pada permukaan media uji.
Kultur uji diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C di dalam inkubator. Setelah masa inkubasi, diameter zona hambat (daerah bening) di sekitar cakram diukur dengan menggunakan jangka sorong. Aktivitas senyawa antimikroba BAL dapat dilihat dengan adanya zona hambat di sekitar cakram. Daerah bening di sekitar cakram menunjukkan uji positif. Isolat yang menunjukkan zona bening terbesar dipilih untuk uji selanjutnya.
3.4.3 Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri asam laktat dilakukan dengan metode Cappucino & Sherman (1987) untuk mengetahui jumlah sel BAL pada Optical Density/OD tertentu dan untuk mengetahui waktu pemanenan BAL. Pembuatan kurva dilakukan dengan menggunakan medium MRSB. Modifikasi dari metode Cappucino & Sherman (1987) ialah jenis media yang digunakan yaitu MRSB. Sebelumnya perlu dilakukan aktivasi terhadap isolat bakteri. Pertama, sebanyak 1 ose kultur kerja diinokulasi ke dalam 10 ml MRSB, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Kedua, sebanyak 1 ml kultur aktivasi pertama diinokulasikan ke dalam 9 ml MRSB. Ketiga, sebanyak 2 ml dari aktivasi kedua dimasukkan ke dalam 18 ml MRSB diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC.
Inokulum untuk kurva pertumbuhan memiliki jumlah sel yang disiapkan dengan cara memindahkan 5 ml kultur dari Erlenmeyer pada aktivasi ketiga ke
19
dalam Erlenmeyer yang berisi 45 ml MRSB dan diinkubasi pada suhu 37 oC. Kerapatan optik (optical density/OD) biakan tersebut diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm hingga kerapatan optiknya setara 0.5. Sebanyak 20 ml (10% v/v) inokulum dengan biakan dengan OD 0.5 Pembuatan kurva pertumbuhan diawali dengan memasukkan 20 ml yang telah diketahui kerapatan optiknya ke dalam 180 ml MRSB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Kurva pertumbuhan dibuat dengan mengukur kerapatan optik dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm setiap 3 jam selama 24 jam. Hasil yang didapat dikonversi sebagai kurva pertumbuhan bakteri yang dapat menjadi acuan sebagai waktu pemanenan bakteri asam laktat pada pengujian selanjutnya.
3.4.4 Enkapsulasi dan Pengeringan Sinbiotik dengan Teknik Ekstrusi
Enkapsulasi Sinbiotik BAL teknik ekstrusi dilakukan dengan metode Reyed (2007). Modifikasi metode ialah jumlah inokulum awal, dan jenis bahan pengkapsul. Tahap awal pembuatan sinbiotik terenkapsulasi dimulai dengan menumbuhkan isolat BAL potensial secara terpisah, masing-masing sebanyak 10% (v/v) dalam MRSB dan diinkubasi pada suhu 37 °C serta dipanen pada fase logaritmik (lama inkubasi sesuai hasil dari penelitian sebelumnya). Sel bakteri dipanen dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 °C selama 20 menit. Sel bakteri yang diperoleh kemudian dilarutkan pada 100 ml campuran yang terdiri atas tepung kedelai 2% (b/v), gliserol 5% (v/v), inulin 2% (b/v), dan Ca 0,1% (b/v), diperangkap selama 45 menit di dalam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3% (b/v). Campuran tersebut diteteskan pada Ca (0,1 M). Setelah satu jam gel dipindahkan dalam larutan fisiologis (0,85%) untuk mendapatkan struktur gel yang kompak. Butiran gel yang terbentuk dipindahkan ke air destilasi dan dilakukan pemutaran secara perlahan selama 1 jam untuk menghilangkan CaCO3 dan mendapatkan butiran yang lebih keras. Selanjutnya dilakukan pengeringan dengan menggunakan metode Hot air oven. Perlakuan kemudian diulangi dengan bahan susu skim 2% (b/v), gliserol 5% (v/v), inulin 2% (b/v), dan CaCO3 0,1% (b/v).
3.4.5 Uji Viabilitas Kapsul Kultur BAL Setelah Enkapsulasi
Uji viabilitas kapsul kultur BAL dilakukan dengan metode Triana et al. (2006). Uji viabilitas dilakukan segera setelah proses enkapsulasi selesai dan setelah disimpan selama 1 bulan pada suhu 4 °C dan 27 °C. Viabilitas sel terenkapsulasi dihitung pada minggu 0, 1, 2, 3 dan 4 dihitung pada suhu 4 °C dan 27 °C dengan menggunakan metode Total Plate Count pada media PCA.
3.4.6 Uji Ketahanan Sel Bebas dan Sinbiotik Terenkapsulasi Dalam Cairan Asam Lambung Tiruan
Uji ketahanan sel bebas dan sinbiotik terenkapsulasi dalam cairan asam lambung tiruan dilakukan dengan metode Wood (2010). Ketahanan sel bebas dan sel terenkapsulasi dalam cairan asam lambung tiruan (0,08 M HCl dengan 0,2% (w/v) NaCl; Rao et al., 1989) yang ditambahkan larutan buffer diuji dengan nilai pH 6, 3 dan 2 (diatur dengan menggunakan NaOH 1 M dan HCl 1 M) . Sebanyak 0,5 ml sel bebas dan sel terenkapsulasi dalam larutan NaCl fisiologis (10-8-10-9 CFU mL-1) masing-masing ditambahkan ke dalam 9,5 ml larutan asam lambung tiruan dan diinkubasi pada suhu 37 oC. Sampel pada cairan asam lambung tiruan pada pH 6 dikeluarkan dari inkubator pada interval waktu 20 menit selama 2 jam, sedangkan pada cairan asam lambung tiruan pada pH 3 dan 2, sampel dikeluarkan dari inkubator pada interval waktu 5 menit selama 30 menit pertama, kemudian pada interval 30 menit hingga 2 jam. Pada setiap interval waktu yang ditentukan, sampel dikeluarkan dari inkubator. Sampel yang mengandung sel terenkapsulasi dihomogenisasi. Sampel diuji viabilitasnya dengan membuat seri pengenceran dalam larutan NaCl fisiologis 0,85% dan dilakukan penghitungan Total Plate Count dalam PCA lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Perlakuan dilakukan duplo.
BAB 4
