Penelitian ini dilaksanakan selama 5 bulan pada tanggal 15 Mei 2017 sampai dengan 15 September 2017. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB BIOGEN), Jalan Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16114, Jawa Barat.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian yaitu counter, baki dan penggaris digunakan untuk karakterisasi fenotipe padi. Adapun alat-alat yang digunakan untuk isolasi DNA, PCR dan elektroforesis diantaranya : eppendorf, mikropipet (1000p, 200p, 20p, 2p), tip berbagai ukuran, cool box, sumpit, waterbath, sentrifus beckman mikrofuge, tisu, incubation shaker, plastik, vortex maxi mix II, vortex spin down, mesin PCR tetrad PTC-225, Erlenmeyer, microwave, gelas ukur, neraca analitik, parafilm, plat tetes, cetakan gel, seperangkat elektroforesis agarose, Gel DocTMImager E.
Material genetik yang digunakan pada penelitian yaitu rumpun dan daun padi galur Sta8-S15-TB16, Si41-S15-TB16, dan Sk56-S15-TB16 tahan blas. Total rumpun yang dianalisis sebanyak lima rumpun, masing-masing rumpun diambil tiga malai (Lampiran 1). Marka molekuler yang digunakan sebagai primer berupa primer SNAP (Single Nucleotide Amplified Polymorphism) terkait dengan gen-gen pengatur karakter morfo-agronomi (Tabel 1). Bahan lain yang digunakan pada penelitian ini yaitu nitrogen cair, buffer Cetyl Trimethyl Ammonium Brommide (CTAB), natrium disulfit, chloroform–isoamilalcohol (24:1) atau chisam, natrium asetat 3 M, isopropanol, etanol 70%, tris-EDTA (TE), tris-borat-EDTA (TBE) 0.5x, RNAse, Ultrapure Water, Agarose, lamda DNA, loading dye, ddH2O, master mix PCR KAPA, ladder DNA dan akuades.
16 Tabel 1. Primer SNAP terkait karakter agronomi (Biogen 2017, Unpublished)
Kode
Primer Krom Sekuen
Panjang primer Suhu Annealing TT1 1 F: 5'CCTCAGACAAGAATGGCATGTCAAATGTATATCTA-3’ 35 bp 62o C R: 5’CGATGGTAACACAATAAAGCAGCATTTTGAA-3’ 32 bp TT3 6 F: R: 5’CCATCAAGGCCGTACCTGGAGGAT-3’ 5’CAAAATGCTATAGTAGAGCCTCATTGACCATATTTT-3’ 24 bp 36 bp 62o C JAT1 1 F: 5’ATTTAATAGCTTAAAATTCAGGAGGGATGTTACTT-3’ 35 bp 62o C R: 5’CATATTCATAAAAGAGGAATATATCATCAGATTGCA-3’ 36 bp SNAP RS7 1 F: R: 5’GATCAGAGATCAATCAGCACCGGTCAA-3’ 5’CCATCCTCACATCCTTTCCCTTCAGAA-3’ 27 bp 27 bp 62o C SNAP RS12 12 F: 5’TTGCCAAACCACAATTGAGGCAAGTAA-3’ 27 bp 62o C R: 5’TTTAAATAAGACAAACGGTCAAACGTTAGACATGAA-3’ 36 bp SNAP RS21 2 F: R: 5’GGTGATTTGATAATCTCACGCTACCTCTTTCA-3’ 5’GGTGACCTTAATGAAGATATGATAAAATGCACTAGA-3’ 32 bp 36 bp 62o C SNAP RS31 1 F: 5’CAAAACAGCATGGCATCATGGATATGTC-3’ 28 bp 61o C R: 5’CCACAATGTGAAACCTGGACGGTGT-3’ 25 bp
Ket: Krom = Kromosom; F = Forward; R=Reverse; TT = Tinggi tanaman; JAT = Jumlah Anakan Total; RS = Refference Sequence,
RS6, RS12 = Panjang malai; RS7 = Umur berbunga; RS21 = Sudut daun bendera; RS31 = Jumlah anakan produktif
3.3 Cara Kerja
1. Karakterisasi Fenotipe
Karakterisasi Fenotipe dilakukan dengan cara mengukur panjang malai padi setiap malai dari beberapa rumpun, setelah itu dilakukan penghitungan jumlah gabah padi total, jumlah gabah hampa dan jumlah gabah padi yang berisi. Untuk karakterisasi fenotipe pada penelitian ini terdapat lima rumpun pada setiap galur, dari lima rumpun tersebut diambil tiga malai padi untuk mengetahui panjang malai, jumlah gabah hampa dan jumlah gabah isi pada setiap malai, selanjutnya dari galur tersebut diambil 100 biji gabah isi untuk ditimbang beratnya menggunakan neraca digital. Data hasil karakterisasi fenotipe kemudian dianalisis menggunakan SAS untuk mengetahui persentase beberapa karakter padi yang memiliki karakteristik fenotipe yang sama dengan Situ Patenggang.
17 2. Isolasi DNA
Isolasi DNA dimulai menyiapkan eppendorf yang telah diberi nama sesuai dengan nama sampel tanaman sebanyak 70 sampel. Daun padi lahan sawah yang telah disemai selama dua minggu lalu dipindahkan ke tanah selama satu minggu, kemudian dipotong lalu dimasukan ke dalam eppendorf. Eppendorf yang telah berisi sampel dimasukan kedalam coolbox yang berisi nitrogen cair, kemudian daun padi pada eppendorf digerus menggunakan sumpit. Penggerusan daun harus dilakukan secara cepat agar jaringan daun yang digerus tetap dalam keadaan beku dan tidak merusak jaringan. Penambahan buffer CTAB sebanyak 750 µl dilakukan segera sampel selesai digerus. Sampel kemudian diinkubasi dalam waterbath selama 20 menit dengan suhu 65oC, setiap lima menit sampel dibolak-balik sebanyak 20 kali. Kloroform–isoamil alkohol (24 :1) kemudian dimasukan sebanyak 750 µl lalu dibolak-balik sebanyak 20 kali, lalu disentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit.
Hasil sentrifuse berupa supernatant dipindahkan ke eppendorf yang baru, kemudian ditambahkan 60 µl Na-asetat 3 M kedalam eppendorf yang berisi supernatant tersebut lalu dibolak-balik pelan selama 10 kali. Selanjutnya ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 50 µl kemudian sampel disimpan di freezer selama 2 jam/overnight. Setelah dua jam kemudian sampel dibolak-balik selama 20 kali kemudian disentrifuse selama 10 menit. Cairan hasil sentrifuse kemudian dibuang dan ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µl dan sentrifuse kembali selama 10 menit. Cairan hasil sentrifuse dibuang dan eppendorf yang berisi DNA (pellet) dikering-anginkan (suhu ruang) selama 1 hari. DNA yang telah menjadi pellet larutkan dengan 50 µl buffer TE dan 1 µl RNAse lalu diinkubasi selama 1 jam dengan suhu 37o C. DNA yang telah diinkubasi selanjutnya dapat digunakan untuk melakukan pengujian kuantitas dan kualitas DNA.
3. Uji Kuantitas DNA
Kuantitas DNA diukur dengan menggunakan spektofotometer nanodrop, diawali dengan memasukan 1 µL Ultrapure Water ke dalam lubang optik spektrofotometer nanodrop untuk membilas nanodrop,
18 kemudian Buffer TE pH 8 sebanyak 1 µL, selanjutnya DNA padi sebanyak 1 µL dimasukan kedalam lubang optik spektrofotometer dan setiap mengganti DNA dikeringkan dengan tisu. Hasil pengukuran nanodrop seperti konsentrasi DNA dan kemurnian DNA dapat dilihat dapat dilihat pada program komputer.
4. Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dengan membuat gel dengan menggunakan agarose 1% dengan 50 ml TBE pada tabung Erlenmeyer. Campuran kemudian dipanaskan dalam microwave selama 2 menit sampai agarose larut, kemudian didinginkan sebentar di air yang mengalir lalu dituangkan ke dalam cetakan gel elektroforesis kemudian didiamkan selama 15 menit. Gel yang terbentuk kemudian dimasukan ke dalam elektroforesis yang telah berisi TBE 0.5x. Plat tetes yang dilapisi parafilm disiapkan untuk mencampurkan 1µl loading dye dengan 3 µl DNA selain itu digunakan marka lamda (λ) 100 ng dan 50 ng sebanyak 3 µl dan loading dye 1 µl yang akan menjadi acuan ukuran DNA dalam nanogram. Kedua campuran kemudian dimasukan ke dalam sumur gel agarose untuk dilakukan elektroforesis dengan voltase 100 volt selama 30 menit. Gel hasil elektroforesis kemudian dimasukan ke dalam Gel Doc imagertm untuk melihat pita DNA yang dihasilkan.
5. Analisis PCR untuk seleksi Polimorfisme Primer
Reaksi PCR untuk optimasi primer ini diawali dengan melakukan pengenceran pada primer yang akan digunakan. Primer yang digunakan pada penelitian ini yaitu primer SNAP agronomi. Pengenceran dilakukan dengan menambahkan ddH2O sebanyak 180 µL untuk masing-masing primer dan 10 µL untuk setiap primer forward dan reverse. Campuran lalu di-vortex dan di-spindown. Setelah melakukan pengenceran primer selanjutnya membuat mix PCR dengan menambahkan KAPA, primer dan ddH2O sebanyak sampel yang dibutuhkan. DNA sebanyak 2 µL dan KAPA yang telah dicampurkan, dimasukan ke dalam eppendorf. Campuran lalu di-spindown dan kemudian masukan pada mesin PCR selanjutnya hasil PCR dapat dianalisis dengan melakukan elektroforesis.
19 3.4 Analisis Data
Data yang didapat dari hasil penelitian berupa data kuantitatif yang terdiri dari data karakterisasi fenotipe dan genotipe padi galur-galur uji. Adapun analisis data yang digunakan untuk karakterisasi fenotipe yaitu ANOVA (Analysis of variance) dengan menggunakan aplikasi SAS. Analisis data hasil karakterisasi genotipe dilakukan dengan menggunakan aplikasi Tasel 3.0 untuk melihat kekerabatan padi galur-galur uji dengan tetua pemulihnya (Situ Patenggang) dan analisis asosiasi fenotipe dan genotipe padi galur-galur uji untuk melihat marka molekuler yang paling signifikan sebagai penanda yang kuat untuk karakter agronomi padi.
20 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN