Penelitian tahap I ini dilaksanakan pada Nopember 2011 sampai dengan Maret 2013. Isolasi dan seleksi bakteri probiotik dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB, dan Laboratorium Nutrisi Ternak, Fakultas Peternakan, IPB untuk analisis aktivitas enzim bakteri.
Isolasi Bakteri
Ikan kerapu yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari dua wilayah berbeda yakni Kepulauan Seribu dan Lampung. Sampel dari Kepulauan Seribu diambil dari karamba pembesaran ukuran ≥100 g sebanyak 4 ekor. Sampel dari Lampung diambil dari panti benih untuk ukuran pendederan (±10 g) sebanyak 5 ekor dan ukuran pembesaran≥100 g sebanyak 4 ekor.
Pengambilan isi saluran pencernaan ikan kerapu sebagai sumber inokulum dilakukan dengan cara mengeluarkan saluran pencernaan (lambung dan usus) dari ikan kerapu fase benih dan dewasa. Usus digerus dan setiap 1 g usus diencerkan dengan 9 mL larutan PBS steril (Lampiran 1). Pengenceran berseri dilakukan dari 10-2 sampai 10-4. Inokulum dikultur dengan metode cawan sebar pada media Sea Water Complete (SWC; Bacto pepton 0.05g, yeast exstract 0.01g, glycerol 0.03 ml, air laut 75 ml, akuades 25 ml, bacto agar 1.5g) yang masing-masing ditambahkan 2 % pati (w/v), 2 % susu skim (w/v), dan 2 % minyak zaitun (v/v). Kultur diinkubasi pada suhu 29oC selama 24 jam. Koloni tunggal yang tumbuh pada media kultur dan memiliki morfologi yang berbeda dikultur secara berulang untuk mendapatkan isolat tunggal yang murni (Madigan et al. 2003). Prosedur isolasi mikroba yang mempunyai aktivitas amilolitik, proteolitik, dan lipolitik dilakukan dengan metode selektif, yang mengacu pada metode yang dilakukan pada hewan terestrial (Hungate 1966), serta mengkombinasikannya dengan prosedur isolasi mikrob dari saluran pencernaan ikan (Nakayama et al. 1994; Hoshino et al. 1997).
Seleksi Bakteri Kandidat Probiotik
Seleksi bakteri kandidat probiotik bertujuan untuk mendapatkan bakteri yang berpotensi dipilih sebagai probiotik. Seleksi dilakukan melalui tahapan pengujian yakni: 1) Uji hidrolisis pati, minyak, dan susu; 2) aktivitas enzim ekstraselular amilase, protease, dan lipase; 3) aktivitas antagonistik dengan bakteri patogen, 4) ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu; 5) kemampuan penempelan; 6) sifat patogenisitas; 7) fase pertumbuhan bakteri; dan 8) identifikasi bakteri.
Uji Hidrolisis Pati, Minyak dan Susu
Pengujian ini bertujuan untuk mengukur besarnya aktivitas amilolitik, lipolitik, dan proteolitik dari masing-masing isolat melalui uji hidrolisis pati, minyak, dan susu. Bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada mediaSea Water Complete(SWC) yang masing-masing telah ditambahkan pati sebanyak 2% (v/w) untuk uji hidrolisis pati, susu skim sebanyak 2% (v/w) untuk uji hidrolisis susu, dan minyak zaitun sebanyak 2% (v/v) untuk uji hidrolisis minyak. Kemampuan menghidrolisis protein ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling isolat yang ditumbuhkan pada media agar dengan penambahan susu skim. Hidrolisis lemak ditandai dengan adanya warna kehijauan pada media agar dengan penambahan minyak zaitun, setelah permukaan media digenangi tembaga (II) sulfat (CuSO4) jenuh. Kemampuan menghidrolisis karbohidrat ditandai dengan
terbentuknya zona bening di sekeliling koloni yang tumbuh, setelah media digenangi dengan reagen kalium iodida (KI) 1%. Prosedur uji hidrolisis pati, minyak, dan susu terdapat pada Lampiran 2.
Pengujian Aktivitas Enzim Amilase, Lipase, dan Protease
Preparasi bakteri untuk pengukuran aktivitas enzim yaitu dengan menginokulasi mikroba ke dalam 10 mL media SWC, diinkubasi dalam shaker waterbathpada suhu 29oC dengan kecepatan 140 rpm selama 24 jam. Inokulum kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 11.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC (Irawadi 1991). Filtrat ekstrak crude enzyme kemudian diambil untuk uji aktivitas enzim amilase, lipase dan protease.
Aktivitas amilase diukur menggunakan pati 1% sebagai substrat dalam buffer natrium fosfat 20 mM, pH 6.9 dan mengandung NaCl 6.0 mM mengikuti metode Bergmeyer and Grassi (1983). Aktivitas lipase dihitung dengan menggunakan emulsi minyak zaitun sebagai substrat dan Tris-HCL sebagai buffer sesuai dengan metode Borlongan (1990). Aktivitas protease dihitung dengan menggunakan kasein sebagai substrat, buffer phosphat 0.05 M pH 7 dan tirosin 5 mmol/L sebagai standar sesuai dengan metode Bergmeyer and Grassi (1983). Metode pengujian aktivitas enzim amilase, lipase dan protease dapat dilihat pada Lampiran 3.
Pengujian Aktivitas Antagonistik
Aktivitas antagonistik (penghambatan) bakteri kandidat probiotik terhadap V. alginolyticus diuji secara in vitro menggunakan metode kultur bersama. Bakteri V. alginolyticus diberi penanda resisten terhadap antibiotik rifampisin 50 µg/mL (Varif). Kandidat bakteri probiotik dan bakteri Varif masing-masing dikultur pada media SWC-broth selama 24 jam dalam shaker waterbath pada suhu 29oC dengan kecepatan 140 rpm. Inokulum kandidat probiotik dengan kepadatan 106 CFU/mL dan Varif 103 CFU/mL masing-masing sebanyak 100 µL dimasukkan ke dalam 10 mL media SWC-broth dan diinkubasi kembali selama 24 jam pada shaker waterbath dengan suhu 29oC dan kecepatan 140 rpm. Sebagai kontrol digunakan bakteri Varif ditambah larutan fisiologis steril (NaCl 0.85%) dan ditumbuhkan pada media SWC-broth. Bakteri Varif yang tumbuh
pada media TCBSrif dihitung dengan metode hitungan cawan (Madigan et al. 2003).
Uji Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu
Ketahanan isolat mikroba terhadap asam lambung dan garam empedu digunakan untuk mengkaji kemampuannya bertahan dalam lambung dan saluran pencernaan yang ber-pH rendah serta garam empedu di bagian atas usus. Pengujian dilakukan menurut metode Ngatirah et al. (2000). Metode ini dilakukan dengan menginokulasi 1,0 mL isolat mikroba ke dalam satu seri tabung yang berisi 9 mL larutan media steril pada pH 2,5 (pH diatur dengan penambahan HCl) dan pH 8,5 (pH diatur dengan penambahan NaOH), kemudian diinkubasi pada suhu 29°C. Pengamatan dilakukan pada 2, 4, 6, dan 8 jam setelah inokulasi dan jumlah mikroba dihitung dengan metode hitungan cawan (Madigan et al. 2003).
Uji Penempelan
Uji penempelan atau adhesi dilakukan dengan mengacu pada Dewanti & Wong (1993), yaitu menggunakan lempeng stainless steel. Pengujian dilakukan dengan cara meletakkan lempeng di dalam 25 mL media pertumbuhan yang diinokulasi dengan 1 mL kultur kandidat bakteri probiotik ke dalam erlenmeyer, kemudian diinkubasi pada suhu 29°C selama 24 jam. Densitas biofilm dianalisis setelah 24 jam dengan cara membilas lempeng dengan larutan PBS (Lampiran 1). Kemudian permukaan lempeng diseka secara merata dengan menggunakan swab. Swab dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 10 mL PBS dan tabung divorteks selama 1 menit. Setelah itu dilakukan penghitungan jumlah bakteri dengan metode hitungan cawan (CFU/cm2).
Uji Patogenisitas
Uji patogenisitas dilakukan untuk mengetahui sifat patogen atau tidaknya kandidat bakteri probiotik yang digunakan. Isolat kandidat probiotik disuntikan pada ikan kerapu bebek (berat rata-rata 4,65±0,44 g) secaraintramusculardengan konsentrasi 106 CFU/mL sebanyak 0.1 mL. Sebagai kontrol positif, ikan kerapu bebek disuntik patogen V. alginolyticus dengan konsentrasi 108 CFU/mL sebanyak 0.1 mL. Kontrol negatif menggunakan larutan BF yang disuntikkan sebanyak 0.1 mL. Setelah disuntik ikan dipelihara dalam akuarium ukuran 60x30x30 cm3dengan kepadatan 5 ekor per akuarium. Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan selama 10 hari.
Penentuan Fase Pertumbuhan Bakteri
Penentuan fase pertumbuhan berguna untuk menentukan bentuk kurva pertumbuhan sehingga dapat digunakan untuk menentukan kecepatan pencapaian fase eksponensial dan waktu generasi bakteri. Persiapan kultur dilakukan dengan cara menginokulasikan 0,1 mL isolat bakteri ke dalam 10 mL media SWC-broth dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29oC. Pengukuran dilakukan setiap 2 jam dengan metode hitungan cawan. Kultur diinkubasi pada suhu 29oC selama 24
jam. Populasi mikroba yang tumbuh ditentukan dalam Colony Forming Unit (CFU) dan dihitung dengan rumus sebagai berikut:
K
PM = --- A x B x C Dimana :
PM = populasi mikroba (CFU/mL) K = jumlah koloni
A = volume inokulasi dalam media pengencer (mL) B = pada pengenceran keberapa koloni mikroba dihitung
C = volume inokulasi dari media pengencer ke media padat (mL)
Identifikasi
Identifikasi isolat bakteri kandidat probiotik terpilih dilakukan dengan menggunakan kit API 20E dan API 20NE. Penentuan penggunaan kit API berdasarkan hasil uji fisiologi dan biokimia seperti pewarnaan Gram, uji motilitas, uji katalase dan oksidase, serta uji fermentasi glukosa (oksidatif /fermentatif) (Tabel 1)
Tabel 1. Hasil uji fisiologi dan biokimia bakteri kandidat probiotik
Isolat Kriteria uji fisiologi dan biokimia
Pewarnaan Gram
Bentuk Motilitas Katalase Oksidase O/F
RM3 - basil + + - +/+
RM4 - basil - + + +/+
RM5 - basil - + + -/-
RM7 - basil + + + +/+
Berdasarkan hasil uji biokimia, kandidat probiotik yang memiliki uji fermentasi glukosa (O/F) positif seperti RM3, RM4, dan RM7 didentifikasi lanjut dengan menggunakan kit API 20E, dan RM5 yang memiliki uji O/F negatif menggunakan kit API 20NE.
Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian isolasi dan seleksi kandidat probiotik dari saluran pencernaan ikan kerapu bebek dianalisis secara deskriptif eksploratif. Bakteri probiotik terpilih berdasarkan hasil analisis digunakan dalam penelitian tahap selanjutnya.