Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca Kebun Percobaan Cikabayan, kemudian dilanjutkan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Penelitian ini telah dilaksanakan sejak bulan Juni 2008 sampai April 2009.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah tiga aksesi hotong (A1, A2, dan A3), aksesi 1 dan 2 merupakan aksesi lokal yang diperoleh dari Dinas Pertanian Kabupaten Buru propinsi Maluku dan aksesi 3 merupakan aksesi hasil pemuliaan dari Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB. Media tanam merupakan campuran tanah dan pasir (1:1 v/v) masing-masing 3 kg. Pupuk dasar terdiri atas pupuk kandang sebanyak 10% dari bobot media dan Urea:SP-36: KCl sebanyak 200:150:200 kg/Ha (Diptan 2003).
Bahan kimia yang digunakan adalah untuk analisis asam askorbat (ASA), prolin, dan klorofil terdiri atas; nitrogen cair, asam askorbat (4,0 mg/l-1), asam metaphosphorik 5%, dicholorophenol-indophenol (DCIP) 0,8 g L-1, ninhidrin, asam asetat glasial, asam fosfat 6 M, asam sulfosalisilik 3%, toluen, prolin murni, aseton 80%, kertas saring (Wathman no 1). Sedangkan untuk preparasi anatomi daun, batang, dan akar tediri atas: alkohol (pa, 95, 70, 60, 50, & 30%), HNO3 40%, larutan pemutih (bahan aktif), safranin 2%, fast green 0.5%, gliserin 30%, larutan albumin gliserin 30%, larutan FAA, larutan giford, larutan seri n-butanol III – VII, paraplas, entelan, dan aquades.
Untuk keperluan penanaman digunakan alat-alat terdiri atas; rumah kaca, ember plastik kapasitas 10 L, timbangan kapasitas 10 kg, gayung, perlengkapan pengolahan tanah, alat ukur, selang air, alat tulis, dan peralatan lapang lainnya. Alat-alat laboratorium yang digunakan terdiri atas; timbangan analitik, oven, freezer -30oC, cool box, spektrofotometer, mortal, corong, vortex, gelas ukur,
pipet volumetrik, pipet tetes, pipet 1 ml, 5 ml dan 10 ml, gelas piala, tabung reaksi, batang pengaduk, bulb, lemari asam, tabung film, gunting, pisau mikrotom, kater, silet, kuas, mikroskop cahaya, cawan petri, gelas objek, cover gelas, pinset, kamera, kertas label, mikrotom putar, botol sampel, luxmeter, bunsen, hotplate, cetakan blok parafin, kotak preparat, dan sebagainya.
Rancangan Percobaan
Penelitian dirancang dan dilaksanakan dengan metode rancangan faktorial dalam rancangan acak kelompok dengan 3 ulangan. Sedangkan faktor yang diamati terdiri atas 2 faktor. Faktor pertama adalah aksesi terdiri atas 3 taraf yaitu; aksesi Buru 1 (A1), aksesi Buru 2 (A2), dan aksesi AGH (A3). Faktor kedua adalah perlakuan terdiri atas 2 taraf yaitu; disiram setiap hari sesuai volume air pada kondisi kapasitas lapang (C0) dan cekaman kekeringan dengan penundaan penyiraman selama 14 hari (CK). Dengan demikian terdapat 18 unit uji dari 6 kombinasi perlakuan dengan 3 kali ulangan. Total tanaman yang disiapkan adalah 126 tanaman. Data yang di peroleh dianalisis dengan sidik ragam RAK dengan uji jarak berganda Duncan (DMRT) sebagai uji lanjut pada tarap kepercayaan 95% (α = 0,05) dengan SPSS versi 13.
Pelaksanaan Penelitian Persiapan bahan tanaman dan media tanam
Pada percobaan ini digunakan 3 aksesi hotong yang diberi 2 perlakuan. Sebelum penanaman, dilakukan persiapan rumah kaca dan media tanam. Media tanam merupakan campuran tanah dan pasir dengan perbandingan 1:1. Masing- masing media tanam di ayak dan ditambahkan pupuk kandang sebanyak 10% dari bobot media kemudian di campur. Setelah dicampur, dilakukan pengukuran kadar air media tanam pada kondisi kapasitas lapang untuk menentukan volume air yang harus ditambahkan pada media.
Penanaman dan pemeliharaan
Benih hotong ditanam langsung pada pot yang telah disiapkan, sebanyak 4 biji/pot untuk setiap perlakuan. Setelah umur satu minggu, tanaman dijarangkan menjadi dua tanaman/pot. Pupuk dasar yang diberikan terdiri atas pupuk kandang sebanyak 10% dari bobot media tanam dan Urea:SP-36:KCl dengan perbandingan 200:150:200 kg/Ha (Diptan 2003).
Penyemprotan untuk pencegahan hama dan penyakit tanaman dilakukan dengan menggunakan insektisida sesuai dengan tingkat dan jenis serangan hama. Selain itu dilakukan penyiangan tanaman pengganggu secara berkala. Penyiraman dilakukan setiap hari secara merata sesuai volume air pada kondisi kapasitas lapang sampai tanaman tumbuh sempurna.
Pemberian perlakuan cekaman kekeringan
Setiap aksesi mendapatkan dua perlakuan, yaitu perlakuan disiram setiap hari (C0), dan tanpa disiram selama 14 hari (CK). Sejak penanaman sampai tanaman berumur 6 minggu, air diberikan sesuai volume air pada kondisi kapasitas lapang. Setelah itu dilakukan penundaan penyiraman selama 14 hari sampai tanaman menunjukkan gejala layu berat. Keadaan layu berat ditandai dengan tanaman tetap layu apabila dipindahkan keruang lembab selama satu malam.
Pengamatan
Pengamatan tanaman dilakukan terhadap Kadar Air Media (KAM), Kandungan Air Relatif (KAR) daun, parameter pertumbuhan meliputi; luas daun, tinggi tajuk, panjang akar, bobot kering tajuk dan akar, dan bobot kering biji, parameter fotosintesis meliputi; efisiensi maksimum fotosintesis (Fv/Fm), pelepasan energi untuk reaksi fotokimia (qP), non fotokimia (qN), dan hasil kuantum fotosinteis (qY), akumulasi asam askorbat (ASA), prolin, dan kandungan klorofil daun. Pengukuran KAM, KAR daun, parameter fotosintesis, akumulasi ASA, prolin, dan kandungan klorofil daun dilakukan pada 0, 4, 8, 12,
14 hari setelah perlakuan (HSP) cekaman kekeringan dan 2 hari setelah pengairan kembali (rewatering). Pengukuran luas daun, tinggi tajuk, panjang akar, bobot kering tajuk dan akar, serta struktur anatomi daun, batang, dan akar melalui pembuatan preparasi sayatan paradermal dan transversal dilakukan pada 14 HSP cekaman kekeringan. Bobot kering biji diukur setelah tanaman berproduksi.
Penentuan KAM dilakukan secara gravimetri dengan mengambil sampel tanah ± 100/g (di bagian atas, tengah, dan bawah). Sampel tanah ditimbang untuk memperoleh bobot basah (BB), kemudian dioven pada suhu 80oC selama 48 jam untuk mendapatkan bobot kering (BK). KAM diperoleh dengan persamaan sebagai berikut:
BB - BK
KAM (%) = x 100% BB
KAR daun ditetapkan mengikuti metode (Barr & Weatherley 1962). Sebanyak 10 bulatan sampel daun diambil menggunakan cork borer berdiameter 1 cm. Selanjutnya sampel daun ditimbang untuk memperoleh bobot segar (BS), kemudian dilakukan hidrasi selama 24 jam di dalam botol film untuk memperoleh bobot jenuh (BJ) yang sebelumnya dikeringkan terlebih dahulu menggunakan kertas tissue. Sampel daun selanjutnya dioven pada suhu 80oC selama 48 jam untuk mendapatkan bobot kering (BK) yang sebelumnya didinginkan terlebih dahulu di dalam desikator. KAR daun diperoleh dengan persamaan sebagai berikut:
BS - BK
KAR daun (%) = x 100% BJ - BK
Luas daun (LD) dihitung dengan mengukur panjang daun (P) yang diukur mulai dari pangkal daun sampai ujung daun terpanjang dan lebar daun (L) yang diukur pada bagian helai daun yang terlebar mengukuti metode Guritno dan Sitompul (1995) dengan persamaan sebagai berikut:
LD (cm2) = P x L x k
k adalah konstanta kalibrasi (0,74).
Tinggi tajuk diukur mulai dari permukaan tanah sampai pada titik tumbuh. Panjang akar diukur mulai dari pangkal akar sampai ujung akar terpanjang, sedangkan bobot kering akar dan tajuk diukur secara terpisah dengan cara dioven pada suhu 80oC selama 48 jam. Bobot kering biji diukur setelah tanaman berproduksi. Biji yang diperoleh dijemur selama 2 minggu di dalam rumah kaca, kemudian ditimbang untuk mendapatkan bobot kering biji.
Pengukuran parameter fotosintesis
Parameter fotosintesis diukur dengan menggunakan alat Photosynthetic Chlorophyll Flourescence Analyzer (Qubit Systems tipe ATC 1). Sampel daun yang diukur adalah daun muda yang berkembang sempurna (daun ketiga). Daun tanaman diletakkan pada kuvet kemudian diadaptasi gelap dengan cara ditutup dengan kain hitam selama 20 menit. Selanjutnya diberi cahaya saturasi (cahaya jenuh). Pada saat di beri cahaya jenuh, fluorescence akan meningkat dari nilai ground state (Fo) ke nilai maksimum (Fm). Dari sini diperoleh nilai efisiensi maksimum fotosintesis (Fv/Fm) dengan persamaan Fv/Fm = (Fm-Fo)/Fm. Selang 2 menit dinyalakan Actinic light, pada kondisi ini flourescence yield meningkat pada kondisi nilai steady state (Ft). Pada interval 20 detik Saturating flash dinyalakan, maka akan meningkatkan flourescence yield pada kondisi maksimum (Fm’) (nilainya akan lebih rendah dari kondisi pada saat adaptasi gelap/tanpa actinic light on). Maka diperoleh photochemical quenching (qP) = (Fm’ – Ft)/(Fm’ – Fo), non-photochemical quenching (qN) = (Fm – Fm’)/(Fm – F0) dan quatum yield (qY) dari transfer elektron pada PSII (qY) = (Fm’ – Ft)/Fm’.
Analisis asam askorbat (ASA)
Analisis asam asakorbat dilakukan mengikuti metode Reiss (1993) dengan titrasi asidialkalimetri yaitu berdasarkan perubahan asam menjadi basa. Sampel
daun segar sebanyak 5 g diekstraksi dalam 10 ml asam metaphosphorik 5%. Hasil ekstraksi difiltrasi dengan kertas saring Wathman no 1. Filtrat yang di peroleh dititrasi dengan dicholorophenol-indophenol (DCIP) 0,8 g L-1. Sebelum dititrasi, dilakukan standarisasi pewarna (larutan DCIP) dengan larutan ASA murni, yaitu 1
ml larutan yang mengandung asam askorbat (4,0 mg L-1) dan 9 ml asam
metaphosphorik 5% dititrasi dengan dicholorophenol-indophenol (DCIP) 0,8 g L-1. Titrasi dihentikan ketika filtrat tepat berwarna merah muda. Kandungan ASA dihitung berdasarkan persamaan sebagai berikut:
1 Untuk standarisasi larutan ASA ( 4 mg ASA murni = 1 ml pewarna): ASA (mg) 4 mg ASA murni
=
1ml DCIP DCIP yang dititrasi (ml)
2 Untuk mengetahui kandungan ASA daun tanaman (ASA / 100 g jaringan daun):
Total volume ekstrak (ml) 100 = (mg ASA) x x
Volume yang dititrasi (ASA) g sampel
Analisis prolin
Kandungan prolin bebas dianalisis mengikuti metode Bates et al. (1973) menggunakan spektrofotometer. Untuk menentukan konsentrasi prolin dalam sampel digunakan prolin murni yang dilarutkan dalam asam sulfosalisilik 3% dengan konsentrasi; 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 ppm sebagai larutan standar. Asam ninhidrin disiapkan sebagai pereaksi dengan menghangatkan 1,25 g ninhidrin dalam 30 ml asam asetat glasial dan 20 ml 6 M asam fosfat pada oven dengan suhu 60oC sampai larut. Kemudian didinginkan dan di simpan pada suhu 4oC. Sebanyak 0,5 g sampel daun diekstraksi dalam 10 ml asam sulfosalisilik 3%, dan difiltrasi dengan kertas saring Wathman no 1. Selanjutnya 2 ml filtrat direaksikan dengan 2 ml asam ninhidrin dan 2 ml asam asetat glasial pada tabung reaksi selama 1 jam pada suhu 100oC. Setelah 1 jam, larutan didinginkan segera di dalam ice-bath. Campuran ini selanjutnya diekstraksi dengan 4 ml toluen, di vorteks selama 20 detik. Hasil pemisahan larutan tersebut di ambil dengan pipet
kemudian diabsorbansi pada λ 520 nm dengan spektrofotometer. Sebagai blangko digunakan toluen. Konsentrasi prolin ditentukan dari kurva standar dan dihitung berdasarkan persamaan sebagai berikut:
(µg prolin / ml x ml toluene) / 115,5 µg / µmol (g sampel) / 5
= µ mol prolin / g bobot segar sampel.
Anlaisis kandungan klorofil
Analisis kandungan klorofil dilakukan mengikuti metode Arnon menggunakan spektrofotometer (Arnon 1949). Sebanyak 1 g sampel daun segar tanpa tulang daun digerus dengan aseton 80%. Supernatan disaring dengan kertas saring dan diencerkan sampai volume 50 ml. Selanjutnya diambil 2,5 ml larutan dan diencerkan lagi sampai volume 25 ml. Kemudian di absorbansi dengan spektrofometer pada λ 663 nm (klorofil a) dan λ 645 nm (klorofil b). Kandungan klorofil a, b, dan total dihitung berdasarkan persamaan sebagai berikut:
Kla = 0,0127 . D663 – 0,00269 . D645 Klb = 0,0229 . D645 – 0,00468 . D663 50 100 Kltot = 20,2 . D645 + 8,02 . D663 x x x 0,5 (mg/g BK) 1000 50
Pembuatan sayatan paradermal
Pembuatan dilakukan berdasarkan metode Sass yang dimodifikasi (Sass 1951). Potongan daun dicuci dengan air kran, kemudian direndam didalam larutan HNO3 40% selama 15 menit dan dipanaskan pada bunsen selama 2 menit. Selanjutnya daun dicuci dengan air kran, kemudian dikerik dengan silet untuk menghilangkan jaringan mesofil sehingga yang tersisa hanya lapisan epidermis. Lapisan epidermis yang diperoleh, direndam di dalam larutan pemutih (bahan aktif) untuk membersihkan jaringan mesofil yang masih menempel. Selanjutnya lapisan epidermis dicuci dengan air kran dan diwarnai dengan safranin 2% selama 1 menit. Lapisan epidermis yang telah diwarnai direkatkan pada objek gelas
yang telah diberi media gliserin 30%. Selanjutnya ditutup dengan cover gelas dan diamati pada mikroskop cahaya. Kerapatan dan indeks stomata pada lapisan epidermis daun bagian atas dan bawah dihitung berdasarkan persamaan (Wilmer 1983) sebagai berikut:
Jumlah stomata Kerapatan stomata =
Luas daun (mm2)
Luas daun diperoleh dari luas bidang pandang lensa objektif dengan perbesaran 10 x 40 dengan persamaan πr2 (π = 3,14 & r = 0,22). Luas daun = 0,152 mm2.
Jumlah stomata
Indeks stomata = x 100% Jumlah stomata + Jumlah sel epidermis
Pembuatan sayatan transversal
Pembuatan sayatan transversal dilakukan menurut metode parafin (Nakamura 1995) yang dimodifikasi. Potongan daun, batang, dan akar (0,5 x 0,5 cm) difiksasi dalam larutan FAA selama 72 jam. Sebelum dilakukan dehidrasi, sampel dicuci dengan alkohol 50 dan 70% masing-masing 1 jam (3 kali). Selanjutnya sampel didehidrasi dalam larutan seri n-butanol III – VII, masing- masing tahap berlangsung 1,5 jam. Pada larutan seri n-butanol ke-7 ditambahkan parafin cair (1:1v/v) kemudian dibiarkan pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah 24 jam, parafin yang tercampur larutan dehidran 7 dibuang dan diganti dengan parafin cair baru setiap 24 jam (3 kali). Sampel dimasukkan kembali ke dalam oven dan dibiarkan selama 3 hari. Selanjutnya dilakukan embedding di dalam larutan parafin. Sebelum penyayatan sampel direndam di dalam larutan giford selama 1 bulan. Sampel disayat dengan mikrotom putar dengan ketebalan 10 µm. Pita parafin yang terbentuk direkatkan pada gelas objek yang diolesi larutan albumin gliserin (1:1) dan diletakkan di atas hotplate bersuhu 40oC sampai pita terbentang sempurna. Pita parafin diwarnai dengan pewarnaan ganda safranin 2% dan fast green 0,5%. Setelah diwarnai, preparat ditutup dengan cover gelas setelah ditetesi dengan entelan.