3.3.1 Tahap Persiapan Kandang
Langkah-langkah persiapan kandang sebelum dimulai penelitian, adalah: 1. Kandang disemprot dengan menggunakan air bersih dan dibersihkan dari
limbah ternak sebelumnya. Kegiatan ini dilakukan sebanyak 2 kali agar kandang benar-benar bersih.
2. Kandang disemprot deterjen dan insektisida dengan komposisi 200 l air ditambah insektisida 500 ml dan 1 kg deterjen.
3. Kandang disemprot formalin 10% dengan komposisi 180 l air ditambah 20 l formalin teknis.
4. Pengapuran lantai dan dinding kandang selama 3-5 hari.
5. Sekam ditaburkan dengan ketebalan 7-12 cm kemudian disemprot fungisida enilconalone 15% dengan konsentrasi 150g/L untuk mencegah penyimpangan hasil penelitian akibat infeksi penyakit sebelum ayam dimasukkan.
3.3.2 Pengelompokan Ayam Penelitian
Hari pertama dilakukan penimbangan DOC dan ditempatkan pada kandang sesuai dengan pengelompokkannya. Hari ke-empat dilakukan vaksinasi ND pada DOC melalui tetes mata. Aklimatisasi dilakukan 7 hari sebelum ayam diberikan perlakuan. Ayam divaksin IBD pada hari ke-11 melalui tetes mata. Vaksinasi ND kembali dilakukan pada hari ke-19 melalui cekokan. Ayam broiler
diberikan pakan komersil dan minum secara ad libitum yang diganti setiap pagi dan sore hari.
Ayam broiler berjumlah 30 ekor dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol (CC0) dan kelompok perlakuan (CC2) yang diberikan Prednisone 3 mg/kg BB secara per oral (Jamin 2011) setiap hari mulai dari umur ayam 2 minggu. Setiap kelompok terdiri dari 15 ekor ayam. Mulai dari umur 1 minggu sampai 6 minggu, sebanyak 3 ekor dari masing-masing kelompok dinekropsi setiap minggunya.
3.3.3 Nekropsi dan Pengumpulan Sampel Organ
Mulai dari minggu kedua sampai minggu keenam sebanyak 3 ekor ayam diambil dari kandang secara acak menurut kelompok per minggunya. Sebelum dinekropsi, ayam dikorbankan dengan cara disembelih. Nekropsi dilakukan untuk mengamati perubahan patologi (PA) dan mengambil organ untuk selanjutnya diamati secara histopatologi (HP). Organ yang diambil adalah timus, limpa, dan bursa Fabricius. Organ-organ tersebut dimasukkan ke dalam pot plastik yang berisi larutan BNF 10% dan diberi label. Setelah organ terfiksasi sempurna di dalam larutan BNF 10% selama 24 jam maka organ siap dijadikan preparat histopatologi.
3.3.4 Pembuatan Preparat Histopatologi
Organ timus, limpa, dan bursa Fabricius yang telah difiksasi dalam larutan BNF 10% dipotong setebal 0.5 cm lalu dimasukkan ke dalam tissue cassette kemudian direndam kembali ke dalam larutan BNF 10%. Proses selanjutnya adalah dehidrasi dengan cara merendam organ berturut-turut ke dalam alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, alkohol absolut I dan alkohol absolut II. Tahapan selanjutnya adalah clearing atau penjernihan dengan xylol kemudian organ direndam dalam paraffin I dan paraffin II. Proses tersebut berjalan secara otomatis dalam alat Sakura® tissue processor.
Tahap selanjutnya adalah meletakkan organ dalam alat pencetak blok paraffin kemudian diisi sedikit paraffin dengan bantuan paraffin embedding console. Letak organ diusahakan tepat berada di tengah blok paraffin. Paraffin
yang sudah mulai mengeras kembali ditambahkan paraffin cair hingga penuh dan dibiarkan sampai beku kemudian dilepaskan dari cetakan. Selanjutnya dilakukan pemotongan jaringan (sectioning) setebal 5µm dengan menggunakan mikrotom. Hasil potongan berupa pita (ribbon) kemudian diletakkan di atas permukaan air pada waterbath dengan suhu 45°C agar lipatan paraffin hilang. Sediaan diangkat dengan menggunakan object glass yang telah diberikan albumin agar organ merekat sempurna. Sediaan diletakkan dalam inkubator bersuhu 60°C selama satu malam.
Sediaan yang sudah berada dalam inkubator selama semalam selanjutnya dideparafinisasi dalam xylol sebanyak dua kali. Proses selanjutnya adalah rehidrasi dengan merendam sediaan dalam alkohol bertingkat mulai dari alkohol absolut sampai dengan alkohol 80% yang lamanya masing-masing 2 menit. Selanjutnya sediaan dibilas dengan air bersih lalu dikeringkan. Setelah kering maka sediaan siap memasuki proses pewarnaan. Sediaan organ timus, limpa dan bursa Fabricius dilakukan pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE).
Pewarnaan HE dimulai dengan merendam sediaan dalam Mayer’s Haematoxylin selama delapan menit, sediaan dibersihkan dengan air mengalir selama 30 detik. Sediaan direndam dalam lithium karbonat selama 15-30 detik, dibersihkan kembali dengan air mengalir. Selanjutnya direndam dalam larutan Eosin selama 2 menit lalu dibersihkan dengan air mengalir hingga akhirnya dikeringkan. Setelah kering, sediaan dicelupkan ke dalam alkohol 95% dan alkohol absolut I masing-masing sebanyak 10 kali, direndam dalam alkohol absolut II selama 2 menit, xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit. Sediaan ditutup dengan cover glass yang sudah diberikan perekat permount. Preparat didiamkan sampai perekat mengering.
3.3.5 Pengamatan Preparat Histopatologi
Pengamatan perubahan histopatologi atau respon organ limfoid dilakukan dengan cara:
1. Pengamatan mikroskopis untuk mengamati jumlah limfosit, jumlah folikel limfoid bursa Fabricius dan limpa, tinggi dan lebar plika bursa Fabricius, serta luas timus terhadap pengaruh bahan imunosupresan kortikosteroid,
yaitu Prednisone 3 mg/Kg BB dan korelasinya dengan pertambahan umur ayam.
2. Pembuatan foto mikrograf digital eye piece camera terhadap perubahan histopatologi pada organ limfoid. Pengamatan pada foto dilakukan dengan luas 2909.09 x 2327.27 µm2.
3. Pengamatan dilakukan dengan menyesuaikan pembesaran okuler dan objektif. Hal ini dilakukan dengan cara seperti yang tercantum pada tabel 2 dibawah ini.
4. Perhitungan jumlah sel dan pengukuran organ dilakukan dengan menggunakan software Image J® for Microsoft Windows®.
Tabel 1 Parameter Penelitian
No Organ Pembesaran Objektif Objek Pengamatan
1 Timus 4x Luas Korteks
Luas Medula 40x
Luas Total Timus Jumlah Limfosit 2 Bursa Fabricius 4x Panjang Plika Bursa
Lebar Plika Bursa 10x Jumlah Folikel Limfoid 40x Jumlah Limfosit
3 Limpa 10x
40x
Jumlah Pulpa Putih Jumlah Limfosit
3.3.6 Pengolahan Data
Hasil data berupa jumlah limfosit bursa Fabricius, timus dan limpa, jumlah folikel limfoid limpa dan bursa Fabricius, panjang dan lebar plika bursa Fabricius, serta luas timus dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji T-student untuk melihat perbedaan nyata antara kelompok kontrol negatif dengan kelompok perlakuan kortikosteroid.