Waktu dan Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2008 sampai dengan Juni 2009 di Laboratorium Mikrobiologi Pangan SEAFAST Center IPB, Laboratorium Pengolahan dan Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian (FATETA) IPB.
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah lumut hati jenis Marchantia paleacea koleksi Taman Lumut Kebun Raya Cibodas, bakteri referensi uji yang digunakan adalah jenis Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas aeruginosa.
Media dan bahan-bahan yang digunakan antara lain adalah Tryptic Soy Agar (TSA), Tryptic Soy Broth (TSB), Plate Count Agar (PCA), etanol, metanol, heksana, etil asetat, aquades, larutan buffer fosfat, dan NaCl 0.85%. Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat untuk ekstraksi, alat-alat gelas, dan peralatan uji mikrobiologi.
Metode Penelitian
Keseluruhan penelitian ini terdiri dari 4 tahap (Gambar 4). Penelitian Tahap I merupakan tahap persiapan bahan baku lumut hati jenis M. paleacea meliputi proses sortasi, pengeringan (suhu ruang selama 14 hari), analisis kadar air (AOAC 1995), serta proses ekstraksi dan persen rendemen. Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan menimbang sebanyak 10 gram lumut kering menggunakan 300 ml (100 x 3) pelarut selama 3 x 24 jam dan digoyang dengan penggoyang (shaker) menggunakan pelarut etanol, metanol, etil asetat, dan heksana (Basile et al. 1998). Kemudian dihitung rendemen yang didapat dari masing-masing ekstrak.
Penelitian Tahap II meliputi uji antimikroba yaitu screening dengan metode agar difusi Sumur terhadap bakteri uji S. aureus, P. aeruginosa dan S. Typhimurium ATCC 14028 (Denyer & Hugo 1991; Garriga et al. 1993) dan
penetapan nilai MIC dan MBC dengan menggunakan medium cair TSB. Nilai MIC dinyatakan sebagai konsentrasi terendah ekstrak lumut yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebanyak 90% atau menurunkan 1 log koloni dari jumlah koloni awal. Sedangkan nilai MBC ditentukan dari cawan dengan konsentrasi ekstrak terkecil yang menunjukkan tidak ada pertumbuhan bakteri atau mampu mereduksi 99,9% (103) dari populasi bakteri awal selama inkubasi 24 jam (Kim et al. 2001).
Penelitian Tahap III terdiri dari analisis komponen fitokimia secara kualitatif terhadap beberapa senyawa yang diidentifikasikan sebagai senyawa antimikroba tumbuhan, diantaranya senyawa fenolik, steroid, triterpenoid, tanin, dan flavonoid (Harborne 1996) dan analisis fenol total (Sakanaka et al. 2003) dengan menggunakan alat spektrofotometer. Tahap akhir penelitian (Tahap IV) meliputi uji kajian efektivitas ekstrak pada berbagai perlakuan pH (4, 6, dan 8) dan uji stabilitas terhadap pengaruh suhu 80 dan 100C selama 20 menit (modifikasi Carson & Riley 1995). Pengujian Tahap II, III dan IV hanya dilakukan terhadap ekstrak lumut yang mempunyai aktivitas antimikroba paling tinggi.
Penelitian Tahap I
Analisis Kadar Air Metode Oven (AOAC 1995)
Kadar air diukur 2 kali terhadap sampel lumut segar dan sampel setelah dikeringkan dengan metode oven biasa karena kandungan bahan volatil pada sampel rendah dan sampel tidak terdegradasi pada suhu 100C. Cawan alumunium kosong dikeringkan dalam oven suhu 105C selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai tidak panas lagi. Cawan ditimbang dan dicatat beratnya. Lalu sampel ditimbang sebanyak 5 gram di dalam cawan tersebut. Sampel dikeringkan dalam oven sampai beratnya konstan (perubahan berat tidak lebih dari 0.003 gram). Setelah itu cawan yang berisi sampel kering di dalam desikator didinginkan dan ditimbang berat akhirnya. Kadar air dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Kadar air (% b/b) = 100% ) ( ) ( a x y x Keterangan:
x = berat cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = berat cawan kosong (g)
Metode Ekstraksi Secara Maserasi (Basile et al. 1998) dan Rendemen Ekstrak
Ekstraksi dilakukan terhadap sampel lumut hati jenis Marchantia paleacea. Sampel dalam bentuk segar dibersihkan dengan air. Pengeringan dilakukan pada suhu ruang (dibiarkan selama 14 hari). Sampel yang kering selanjutnya diblender dan disaring sehingga didapatkan sampel dalam keadaan bubuk kering.
Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan menimbang sebanyak 10 gram sampel dengan menggunakan 300 ml (100 x 3) pelarut etanol selama 3 x 24 jam dan digoyang dengan penggoyang (shaker). Selanjutnya campuran disaring
dengan penyaring vakum menggunakan Whatman 42. Ketiga filtrat yang didapat dicampur dan disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm, supernatan kemudian dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 40°C dengan tekanan rendah (13,5 kgf/cm2). Untuk menguapkan sisa pelarut dilakukan penghembusan dengan N2.
Perlakuan serupa dilakukan terhadap pelarut metanol, etil asetat, dan heksana (Gambar 5). Rendemen ekstrak masing-masing pelarut dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Rendemen ekstrak terhadap berat sampel awal:
=
Penelitian Tahap II
Uji Aktivitas Antimikroba dari Ekstrak Dengan Metode Agar Difusi Sumur (Denyer & Hugo 1991; Garriga et al. 1993)
Untuk mendapatkan ekstrak lumut terpilih yang mempunyai aktivitas antimikroba tertinggi, pengujian didasarkan atas kemampuan menghasilkan zona penghambatan berupa diameter penghambatan terhadap bakteri uji yang ditumbuhkan pada media agar. Empat macam konsentrat ekstrak di uji aktivitas antimikroba terhadap bakteri Staphylococcus aureus, S. Typhimurium ATCC 14028, dan Pseudomonas aeruginosa secara kualitatif dengan metode difusi sumur.
Kultur bakteri uji yang akan digunakan, sebelumnya ditumbuhkan dahulu selama 24 jam dalam medium Tryptic Soy Broth (TSB) pada suhu optimumnya. Jumlah sel bakteri pada medium tersebut adalah sampai 108 CFU/ml. Selanjutnya kultur murni bakteri uji dalam TSB tersebut diencerkan sampai 106 CFU/ml dan diinokulasi sebanyak 1ml ke dalam medium agar (TSA). Masing-masing didistribusikan sebanyak 25 ml ke dalam cawan petri steril serta ditunggu sampai membeku. Setelah itu dibuat sumur dengan diameter 6 mm dan dimasukkan ekstrak sebanyak 60 µl dengan konsentrasi ekstrak sebesar 100 mg/ml.
Selanjutnya diamati adanya penghambatan pertumbuhan mikroba yang ditunjukkan dengan adanya areal bening disekitar sumur dan dilakukan pengukuran besar diameter (d=2r) penghambatan dalam milimeter. Pengukuran dilakukan pada beberapa sisi dan dirata-ratakan. Hasil terbaik dengan zona penghambatan terbesar kemudian dipilih untuk penelitian lanjutan.
Penentuan MIC dan MBC Ekstrak Kasar Terpilih (Kim et al. 2001)
Ekstrak lumut terbaik dari metode difusi sumur kemudian dipilih dalam penentuan MIC (Minimum Inhibitor Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration). Prosedur penentuan MIC dan MBC ekstrak dilakukan sebagai berikut: inokulum yang telah dibiakkan pada Tryptic Soy Broth (TSB) selama 24 jam diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam masing-
masing tabung yang telah berisi TSB dan ekstrak lumut dengan formulasi ekstrak yang telah ditetapkan. Inkubasi dilakukan secara goyang dengan kecepatan 150 rpm sesuai suhu optimum pertumbuhan masing-masing mikroba uji selama 24 jam. Pengamatan dilihat pada kekeruhan kultur dan dilakukan metode plating untuk menghitung jumlah bakteri.
Analisis Total Mikroba (Total Plate Count)
Analisis total mikroba dilakukan pada penelitian ini merujuk pada metode Bacteriological Analytical Manual (BAM) tahun 2001, sebanyak 1 ml sampel dipipet dari pengenceran yang dikehendaki ke dalam cawan petri. Sebanyak ± 12 – 15 ml media PCA dituang ke dalam cawan petri dan segera setelah penuangan agar, cawan petri digerakkan secara perlahan untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata. Setelah agar membeku cawan diinkubasi pada suhu 37C selama 48 jam dan penghitungan koloni dilakukan dengan metode Bacteriological Analytical Manual (BAM).
Proses perhitungan total bakteri dilakukan dengan berbagai ketentuan berdasarkan BAM (2001), antara lain:
1. Cawan yang normal berisi 25 – 250 koloni. Semua koloni dihitung termasuk titik yang berukuran kecil. Pengenceran dan jumlah koloni semua dicatat untuk setiap cawan.
2. Cawan yang berisi lebih dari 250 koloni dicatat sebagai TBUD (terlalu banyak untuk dihitung). Jika tidak ada koloni yang tumbuh maka ditulis kurang dari 1 kali pengenceran terendah.
3. Rumus perhitungan yang digunakan adalah: Untuk sampel 25 – 250 koloni:
N = C / [ (1 x n1) + (0.1 x n2)] x (d) Dimana : N = Total bakteri
C = Jumlah seluruh koloni yang dihitung n1 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = Jumlah cawan pada pengenceran kedua d = Pengenceran pertama atau yang terkecil
Penelitian Tahap III
Analisis Fitokimia (Harborne 2006)
Pada tahap ini dilakukan analisis fitokimia secara kualitatif terhadap beberapa senyawa yang diidentifikasikan sebagai komponen dari senyawa antimikroba tumbuhan lumut hati jenis Marchantia paleacea, di antaranya senyawa fenolik, steroid, triterpenoid, tanin, dan flavonoid.
Senyawa fenolik
Sebanyak 1 ml sampel diteteskan pada spot plate dan ditambahkan NaOH 10%. Terbentuknya warna merah menandakan uji positif adanya senyawa fenol hidrokuinon.
Senyawa steroid dan triterpenoid
Sebanyak 1 mg sampel yang telah kering dilarutkan 2 ml kloroform. Kemudian larutan ditambahkan 10 tetes asam asetat anhidrida dan 3 tetes asam sulfat pekat. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna hijau (senyawa steroid) dan warna merah atau ungu (triterpenoid).
Senyawa tanin
Sebanyak 1 gram sampel dimasukkan ke dalam gelas piala lalu ditambahkan 12 ml air panas dan dididihkan selama 15 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan beberapa ml larutan FeCl3 1%. Timbulnya warna biru tua atau hijau
kehitaman menunjukkan tanin positif.
Senyawa flavonoid
Sebanyak 1 ml atau 1 gram sampel dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan didihkan selama 5 menit, setelah itu disaring dan filtratnya (10 ml) ditambahkan 0,5 gram serbuk magnesium 2 ml alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volume yang
sama) dan 20 ml amil alkohol. Selanjutnya dikocok dengan kuat. Terbentuknya warna merah, kuning dan jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
Analisis Fenol Total (Sakanaka et al. 2003)
Sebanyak 0.1 gram sampel, diekstrak dengan 5 ml aqueus methanol 85%, dihomogenkan dan disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, hingga diperoleh supernatan. Supernatan disaring hingga diperoleh filtrat. Filtrat ditera sampai volume 5 ml dalam labu takar. Filtrat dipipet sebanyak 0,4 ml dan ditempatkan pada tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,4 ml reagen Folin– Ciocalteu, selanjutnya divorteks hingga homogen dan didiamkan 6 menit sebelum ditambahkan 4,2 ml 5% larutan sodium karbonat. Sampel didiamkan selama 90 menit pada suhu ruang sebelum dibaca serapan warnanya pada panjang gelombang 760 nm. Kurva standar dibuat dengan melarutkan asam galat dalam metanol 85% dengan berbagai konsentrasi 10 – 100 mgL-1. Perhitungan fenol total menggunakan rumus persamaan regresi y = ax + b.
Penelitian Tahap IV
Kajian Efektivitas Ekstrak Pada Berbagai Perlakuan pH dan Stabilitasnya Terhadap Pengaruh Suhu (modifikasi Carson & Riley 1995)
Untuk medium pengujian efektivitas ekstrak terhadap pengaruh pH digunakan TSB sebagai medium dengan pH awal 6.8, pH ini digunakan sebagai kontrol negatif. Selanjutnya nilai pH medium ditetapkan pada pH 4, 6, dan 8 menggunakan HCl dan NaOH 0,1 N. Kemudian konsentrat ekstrak dengan konsentrasi 10 mg/ml dimasukkan ke dalam medium uji, berikutnya dipipet kultur dari masing-masing bakteri uji dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C.
Pada uji stabilitas ekstrak terhadap pengaruh suhu, medium TSB yang telah mengandung ekstrak dipanaskan terlebih dahulu masing-masing pada suhu 80 dan 100C, selama 20 menit. Selanjutnya didinginkan sebelum dipipet kultur dari masing-masing bakteri uji dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C.
Analisis Data
Data hasil penelitian diolah secara statistik dengan menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA), yang dilanjutkan dengan uji Duncan apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata antar sampel menggunakan Software SPSS 16.0 Production Facility.