4.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2010 hingga bulan Juni 2010 bertempat di Laboratorium Fitokimia, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.
4.2 Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain Rotary Evaporator, Syringe Driven Filter Unit (Miller GP) ukuran 0.22 µm,
test tube mixer (Vortex Sibata), vial, UV cabinet, chamber, petridish, , lemari asam, neraca analitik, Laminar Air Flow (LAF), pipa kapiler, autoklaf, micropipet, tabung reaksi, rak tabung reaksi, shaker, pipet tetes, gelas ukur, beker glass, vial, ampul, mikrotiter plate, kromatografi kolom, erlenmeyer, inkubator shaker, refrigerator, HPLC (Shimadzu LC-20 ab), LCMS (LCT Premier XE).
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat senyawa alkaloid Arcangelisia flava L. Merr (palmatin), isolat jamur AFKR-3, plat TLC (TLC silica gel 60 F254), sephadex LH-20, metanol, diklorometan, asam asetat glasial, reagen dragendorf, vanilin, amoniak 25%, Ce(SO4)2, aquades, isopropanol, etil asetat, n-hexan, metanol
90%, etanol 70%, asetonitril, air miliphore, aquabides, larutan dimetil sulfoksida, (DMSO), medium Potato Dextro Broth (PDB), medium
Potato Dextro Agar (PDA).
4.3 Metode Penelitian
Kegiatan yang dilakukan untuk mencapai sasaran :
1. Penyiapan alat dan bahan yang akan digunakan 2. Identifikasi Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr 3. Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3
4. Scaling up biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 5. Ekstraksi hasil biotransformasi
6. Partisi ekstrak hasil biotransformasi
7. Fraksinasi ekstrak hasil biotransformasi dengan kromatografi kolom 8. Purifikasi fraksi hasil biotransformasi dengan TLC preparatif
9. Karakterisasi senyawa hasil biotransformasi dengan spektoskopi massa
4.4 Prosedur Kerja
4.4.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Akar Kuning
(Arcangelisia flava L. Merr)
Untuk identifikasi isolat fraksi 4 Arcangelisia flava.L Mer yang diduga sebagai senyawa palmatin dilakukan dengan membandingkan fraksi 4 tersebut dengan standar palmatin HCl. Identifikasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) , HPLC dan spektroskopi massa. Sebelum dilakukan KLT senyawa palmatin HCl terlebih
dahulu dipreparasi untuk mendapatkan palmatin bebas. Palmatin HCl dilarutkan dengan diklorometan : air (1:1) kemudian ditambahkan NH4OH, dikocok dan didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan diklorometan diambil dan dipekatkan. Selanjutnya ekstrak diklorometan dan fraksi 4 dari Arcangelisia flava. L. Merr dianalisis dengan KLT, dimana fase gerak yang digunakan adalah diklorometan : metanol (6 : 1) dengan penambahan 1 tetes asam asetat glasial. Untuk analisis HPLC, kolom yang digunakan adalah Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm. Dan untuk analisis dengan spektoskopi massa digunakan LCMS LCT Premier XE.
4.4.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
Dalam penelitian ini strain jamur yang digunakan adalah salah satu isolat jamur filament yang sebelumnya telah diisolasi dari akar kuning
Arcangelisia flava (L) Merr yaitu jamur AFKR-3. 1. Pembuatan Medium Kultivikasi
Sebanyak 2.4 g medium PBD difco dilarutkan dengan 100 mL air sumur ke dalam erlenmeyer 300 ml , kemudian diaduk hingga melarut. Erlenmeyer ditutup dengan karet silikon dan selanjutnya medium tersebut disterilkan dengan autoklaf pada temperatur 121°C selama 20 menit.
2. Kultivasi Jamur Endofit
Isolat jamur AFKR-3 yang telah ditumbuhkan pada medium Potato Dextro Agar /PDA dipotong kecil dengan ukuran kurang lebih 0.5 x 0.5 cm sebanyak 4 buah. Kemudian jamur tersebut dipindahkan ke dalam medium PBD (Potato Dextro Broth) yang sebelumnya telah disterilkan dan didinginkan. Kultivasi jamur endofit ini di kerjakan dalam LAF (Laminar Air Flow) . Medium PDB yang telah berisi jamur endofit tersebut kemudian dishaker pada temperatur 27°C dengan kecepatan 120 rpm.
3. Penambahan Substrat pada Kultur
Substrat yang ditambahkan pada kultur adalah alkaloid F-4 yang telah diisolasi dari Arcangelisia flava L. Merr (senyawa palmatin). Penambahan substrat dilakukan bertahap sebanyak 2 kali, penambahan yang pertama dilakukan setelah 1 hari kultivasi atau setelah jamur berumur 1 hari. Sedangkan penambahan substrat yang kedua dilakukan tiga hari kemudian, setelah 4 hari kultivasi. Substrat yang ditambahkan harus dalam keadaan steril, sehingga dilakukan filtrasi menggunakan Syringe Miller GP dengan dimeter pori 0.02 µm. Penyaringan dilakukan dalam keadaan steril di Laminar Air Flow. Untuk penambahan substrat yang pertama, sebanyak 1 mL filtrat dengan konsentrasi 10 % metanol dalam 1 mg/ mL dipipet dan kemudian masing-masing dimasukan ke dalam kultur jamur endofit. Dan untuk penambahan substrat yang kedua, sebanyak 10 ml substrat (1 mg/ mL metanol ) dipipet dan dimasukan ke dalam kultur jamur.
Selanjutnya kultur jamur dan substrat dishaker pada temperatur 27°C dengan kecepatan 120 rpm.
4. Monitoring Hasil Biotransformasi
Dalam monitoring hasil biotransformasi dilakukan penyamplingan terhadap kultur jamur AFKR-3 yang telah ditambahkan substrat. Sampling pertama dilakukan setelah 24 jam penambahan substrat pada kultur jamurtersebut . Penyamplingan dilakukan dengan memipet 5 ml substrat + kultur yang ada dalam erlenmeyer kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu diekstraksi dengan pelarut dikrlorometan : metanol dengan perbandingan 5:1 sebanyak 5 ml. Selanjutnya campuran tersebut di vortex dan didiamkan beberapa menit hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah kemudian dipipet dan dipindahkan ke labu evap dan diuapkan. Ekstrak kental kemudian di monitoring dengan TLC (absorben : silica gel dan eluen diklorometan: metanol (6:1) dengan penambahan asam asetat glasial 1 tetes. Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm , dan kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf.
4.4.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
1. Pembuatan Medium Kultivasi
Sebanyak 24 gram medium PDB difco dilarutkan dalam 1 liter air. Setelah semua komponen melarut, medium tersebut dibagi ke dalam 5 erlenmeyer 500 mL masing-masing sebanyak 200 mL dan ditutup
dengan karet silikon. Selain itu di buat pula medium PDB untuk kontrol . Keenam erlenmeyer tersebut kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121 °C selama 20 menit.
2. Kultivasi Jamur Endofit AFKR-3
Isolat jamur AFKR-3 yang telah ditumbuhkan pada medium PDA ( Potato Dextro Agar ) dipotong kecil dengan ukuran kurang lebih 0.5 x 0.5 cm sebanyak 4 buah. Kemudian jamur tersebut dipindahkan ke dalam 6 erlenmeyer yang berisi medium PDB yang sebelumnya telah disterilkan dan didinginkan . Pengerjaan kultivasi ini dilakukan dalam keadaan steril di LAF (Laminer Air Flow). Medium PDB yang telah berisi jamur endofit kemudian dishaker pada temperatur 27 °C dengan kecepatan 120 rpm.
3. Penambahan Substrat pada Kultur
Substrat yang ditambahkan adalah senyawa palmatin. Penambahan substrat dilakukan bertahap sebanyak 2 kali, penambahan yang pertama dilakukan setelah jamur berumur 1 hari setelah kultivasi. Sedangkan penambahan substrat yang kedua dilakukan setelah 4 hari kultivasi. Substrat di tambahkan pada kelima erlemeyer yang telah berisi medium dan jamur, sedangkan untuk medium kontrol tidak diberikan substrat. Substrat yang ditambahkan harus dalam keadaan steril, sehingga dilakukan filtrasi menggunakan Syringe Miller GP
dengan dimeter pori 0.02 µm. Penyaringan dilakukan di Laminar Air Flow. Untuk penambahan substrat yang pertama, sebanyak 2 mL substrat dengan konsentrasi 1 mg/ mL methanol dipipet dan
kemudian masing-masing dimasukan ke dalam kultur jamur endofit. Dan untuk penambahan substrat yang kedua, sebanyak 20 ml substrat mg (1 mg / mL metanol ) dipipet dan dimasukan ke dalam kultur jamur. Kemudian keenam erlenmeyer tersebut dishaker kembali pada temperatur 27 °C dengan kecepatan 120 rpm.
4. Monitoring Hasil Biotransformasi
Monitoring hasil biotransformasi dilakukan dengan penyamplingan terhadap kultur jamur AFKR-3 yang telah ditambahkan substrat palmatin . Sampling dilakukan setelah 6 hari penambahan substrat pada kultur jamur tersebut. Penyamplingan dilakukan dengan memipet 5 ml kultur dalam medium PDB (Potato Dextro Broth ) yang telah ditambahkan substrat, kemudian campuran tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu, campuran diekstraksi dengan dikrlorometan : metanol dengan perbandingan 5:1 sebanyak 5 ml. Campuran tersebut divortex dan didiamkan beberapa menit hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah kemudian dipipet dan dipindahkan ke labu evap dan dipekatkan . Ekstrak pekat kemudian dimonitoring dengan KLT (absorben : silica gel dan eluen: diklorometan:metanol ( 6 : 1) yang ditambahkan 1 tetes asam asetat glasial). Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm dan kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf.
4.4.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
pada medium PDB (Potato Dextro Broth)
Setelah 14 hari dari penambahan substrat, kultur jamur AFKR-3 beserta biomassanya diekstrak dengan pelarut diklorometan : metanol ( 5 : 1 ) . Jamur dan biomassa dalam medium PDB terlebih dahulu di hancurkan, kemudian masing-masing ditambahkan pelarut dan di stirer selama beberapa menit. Ekstraksi dilakukan kurang lebih 3 kali. Hasil ekstraksi kemudian disaring dan filtrat dipisahkan dengan menggunakan corong pisah. Campuran di kocok selama beberapa saat, kemudian didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Selanjutnya lapisan bawah (diklorometan:metanol) diambil. Setelah itu ekstrak dikeringkan dengan rotary evaporator. Ekstrak pekat kemudian di KLT (absorben : silica gel dan eluen diklorometan-metanol = 6 : 1 yang ditambahkan 1 tetes asam asetat). Untuk perbandingan sampel palmatin di TLC pula. Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf untuk mengetahui apakah reaksi biotransformasi berjalan atau tidak . Noda yang muncul juga disemprot dengan pereaksi serium untuk mengetahui apakah banyak terkandung asam-asam lemak dari noda-noda yang muncul. Ekstrak pekat diklorometan : metanol juga dianalisis dengan HPLC Shimadzu LC-20 ab, dimana kolom yang digunakan adalah Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm.
4.4.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3 (Ekstrak Diklorometan-Metanol)
Partisi ekstrak dilakukan dengan corong pisah dengan melarutkan ekstrak pekat diklorometan:metanol dengan metanol . Selanjutrnya larutan metanol tersebut ditambahkan dengan sejumlah n-hexan, untuk kemudian dipartisi dalam corong pisah. Campuran tersebut dikocok dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah (lapisan metanol) diambil dan di pekatkan. Ekstrak pekat metanol kemudian di KLT kembali (absorben : silica gel dan eluen diklorometan-metanol = 6 : 1 yang ditambahkan 1 tetes asam asetat glasial).
4.4.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi Palmatin
oleh Jamur AFKR-3
Fraksinasi ekstrak dilakukan dengan kromatografi kolom. Ekstrak metanol diisolasi dengan menggunakan kolom kromatografi sistem isokratik dimana fasa diamnya adalah sephadex LH- 20 dan fasa geraknya metanol 90%. Ukuran kolom yang digunakan adalah 2.5 x 100 cm. Hasil isolat ditampung ke dalam tabung reaksi dan isolat dalam setiap tabung dicek dengan KLT (absorben = silika dan eluen = diklorometan-metanol = 6:1 [7 ml ] yang ditambah 1 tetes asam asetat glasial ). Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf. Jika diperoleh Rf atau noda yang sama maka isolat digabung dan dijadikan ke dalam satu fraksi.
4.4.7 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)
Dalam tahapan ini, fraksi 1 dipurifikasi dengan menggunakan KLT preparatif (adsorben : silica gel 60 F245 dengan eluennya etil asetat : isopropanol : amoniak 25 % = 8 : 8 : 5 ). Selanjutnya noda yang muncul diamati dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Setelah itu noda yang muncul itu dikerok kemudian dilarutkan dengan diklorometan, metanol, dan kloroform, lalu disaring dengan menggunakan kertas saring. Hasil yang diperoleh dikeringkan dan kemudian di KLT dengan eluen etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8:8:1). Noda yang muncul diamati dan disemprot dengan reagen dragendorf serta dihitung nilai Rf-nya.
4.4.8 Karakterisasi Senyawa Hasil Biotransformasi
Karakterisasi hasil biotransformasi dilakukan dengan analisis menggunakan Spektroskopi Massa. Produk biotransformasi yang diperoleh diinjeksikan ke dalam LCMS LCT Premier XE dengan metode direct inlet.
BAB V