i
BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR ENDOFIT
DARI TUMBUHAN AKAR KUNING
(
Arcangelisia flava
L.Merr : MENISPERMACEAE)
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi
Oleh :
Wida Kharismaya
NIM : 106102003376
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN & ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
ii NAMA : WIDA KHARISMAYA NIM : 106102003376
JUDUL : BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR
ENDOFIT DARI TUMBUHAN AKAR KUNING
(Arcangelisia flava L. Merr : MENISPERMACEAE)
Disetujui oleh :
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Andria Agusta____
NIP. 196908161994031003 NIP. 197308222008012007 Zilhadia M.Si, Apt
Mengetahui,
Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
NIP. 330003139
iii
Skripsi dengan judul
BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava L. Merr :
MENISPERMACEAE)
Telah disetujui, diperiksa dan dipertahakan dihadapan tim penguji oleh Wida Kharismaya
NIM: 106102003376
Menyetujui, Pembimbing:
1. Pembimbing I Dr. Andria Agusta ... 2. Pembimbing II Zilhadia, M.Si, Apt. ...
Penguji:
1. Ketua Penguji Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ... 2. Anggota Penguji I Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ... 3. Anggota Penguji II Ofa Suzanti Betha, M.Si.Apt ... 4. Anggota Peguji III Azrifitria, M.Si, Apt. ...
Mengetahui,
Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Prof. DR. (hc). dr. M.K. Tadjudin, Sp. And
iv
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul :
BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava L. Merr :
MENISPERMACEAE)
Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Ilmu adalah sebaik-baiknya perbendaharaan dan yang paling
indahnya adalah ia ringan dibawa, namun besar manfaatnya.
Ditengah-tengah orang banyak ia indah, sedangkan dalam
kesendirian ia menghibur.”
Skripsi ini saya persembahkan kepada :
Ayahanda dan Ibunda tercinta yang dengan kasih sayang serta doa yang tak pernah putus selalu mengiringi langkah ananda dalam menuntut ilmu. Mungkin selama ini ananda belum dapat memberikan yang terbaik untuk ayah
dan ibu, tapi semoga karya kecil ini dapat membuat ayah dan ibu sedikit bangga kepada ananda . Doakan ananda semoga ananda dapat melanjutkan perjalanan ini dan semoga ilmu yang telah ada dapat selalu ananda amalkan
dan bermanfaat bagi orang banyak. Amiin…
Keluarga besar Farmasi UIN Jakarta yang selama kurang lebih empat tahun mewarnai perjalanan saya dalam menuntut ilmu pengetahuan. Terimakasih kepada dosen-dosen farmasi yang telah dengan sabar memberikan didikan dan
bimbingan kepada saya. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat khususnya bagi saya pribadi dan bagi rekan-rekan farmasi sekalian.
Keluarga besar Puslit LIPI Cibinong khususnya untuk Dr. Andria Agusta dkk (keluarga besar Lab Fitokimia ) yang telah memberikan kesempatan dan bimbingan kepada saya dalam melakukan penelitian. Sungguh pengalaman yang sangat luar biasa bagi saya , karena banyak ilmu dan pelajaran berharga
yang saya dapatkan selama penelitian di sana.
“Ya Allah , sesungguhnya aku menitipkan kepada-Mu apa yang
telah Engkau ajarkan kepadaku , maka kembalikanlah kepadaku
pada saat aku membutuhkannya dan janganlah Engkau jadikan aku
vi
Puji syukur Kehadirat Allah SWT Yang Maha Kuasa , karena berkat rahmat dan kuasa-Nya serta kasih sayang-Nya yang tak pernah putus, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Biotransformasi Palmatin oleh Jamur Endofit dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava L. Merr : Menispermaceae)”.
Penyusunan skipsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Karena itu pada kesempatan kali ini dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada yang terhormat:
1. Bapak Dr. Andria Agusta dan Ibu Zilhadia, M.Si, Apt. sebagai pembimbing dalam skripsi ini yang telah meluangkan banyak waktu dengan sabar dalam memberikan pengarahan, bimbingan, motivasi, nasehat, serta petunjuk dari awal penelitian hingga skripsi ini dapat terselesaikan.
2. Bapak Prof. Dr (hc). Dr, M. K Tadjudin, Sp. And, selaku dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melakukan penelitian.
3. Bapak Drs. M. Yanis Musdja M. Sc, Apt sebagai ketua jurusan Farmasi yang telah memberikan kesempatan dan dukungannya kepada penulis dalam menyelesaikan penyusunan skripsi ini.
4. Ayahanda Drs. Sutiono dan Ibunda Eti Hernawati S.Pd yang selalu memberikan kasih sayang dan dukungan baik moral maupun materil sehingga skripsi ini dapat terselesaikan. Juga kepada semua keluarga tercinta yang tidak henti-hentinya memberikan dukungan dan doanya. 5. Dosen-dosen Farmasi UIN yang selama ini telah sabar mendidik dan
membantu serta staf akademik farmasi yang telah membantu penulis sejak awal masuk perkuliahan hingga akhirnya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini .
vii
7. Teman-teman program studi Farmasi , Suvrela, Eka W, Syifa, Amalia serta teman lainnya khususnya angkatan 2006 yang selama kurang lebih empat tahun telah melewati hari demi hari dengan kebersamaan yang indah dan selalu memberikan dukungan dan doanya kepada penulis. Juga kepada kakak-kakak kelas yang telah memberikan motivasi dan doanya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
8. Teman-teman biosains community 2010 Yaya, Naomi, Dini Fris, Dini Mai, Reza, Rijal dan Emil yang telah memberikan doa dan dukungan serta bantuannya kepada penulis selama penelitian berlangsung hingga skripsi ini dapat terselesaikan.
9. Teman-teman PML , mas dede , mba lia dan semuanya yang telah memberikan bantuan serta doanya untuk penulis hingga skripsi ini dapat terselesaikan.
10.Abdul Wahab, S.E dan keluarga yang selalu memberikan semangat dan doanya dari sejak penelitian, sidang hasil hingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik.
11.Semua pihak yang telah membantu dari awal hinga akhir penyusunan skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.Terimakasih untuk doa dan dukungannya.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan, seperti tak ada gading yang tak retak seperti itulah penulis sangat mengharapkan kritik dan saran agar skripsi penelitian ini benar-benar bermanfaat untuk kita semua. “Amin”
Jakarta, Juli 2010
viii
TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava L. Merr: MENISPERMACEAE)
Salah satu jamur endofit yang diperoleh dari tumbuhan akar kuning (Arcaangelesia flava L. Merr.) yaitu, AFKR-3 telah diketahui mampu melakukan biotransformasi berberin. Dalam penelitian ini, dilakukan serangkaian penelitian untuk mengetahui kemampuan jamur AFKR-3 tersebut dalam mentransformasi senyawa alkaloid lainnya yaitu palmatin. Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 dilakukan di dalam medium PDB (Potato Dextro Broth). Penambahan substrat dilakukan secara bertahap, pertama dengan penambahan larutan palmatin sebanyak 2 ml (1 mg/ml methanol) setelah kultur berumur 1 hari. Kemudian penambahan yang kedua dilakukan setelah kultur jamur berumur 4 hari dengan jumlah larutan substrat sebanyak 20 ml. Setelah kultur diinkubasi selama 2 minggu seluruh medium dan biomassa diekstraksi dengan pelarut diklorometan : methanol (5:1). Ekstrak pekat dikrometan-metanol dilarutkan dengan methanol kemudian dipartisi dengan n-hexan untuk menghilangkan asam-asam lemak dan senyawa non polar lainnya yang terbentuk. Selanjutnya ekstrak pekat metanol di fraksinasi dengan kromatografi kolom dengan fase diam sephadex LH-20 (275 ml) dan fase gerak methanol 90%. Dari fraksinasi diperoleh 2 fraksi (fraksi 1 dan fraksi 2) yang menunjukan adanya senyawa palmatin dan produk biotransformasinya. Fraksi 1 di purifikasi dengan KLT preparatif untuk memperoleh isolat murni. Dari hasil isolasi diperoleh 3 produk biotransformasi dengan nilai Rf masing-masing (P1, 1.6 mg) 0.54, (P2, 1.6 mg) 0.52, (P3, 2.1 mg) 0.5. Hasil spektroskopi massa P3 menunjukan bahwa terjadi penambahan bobot molekul sebanyak 16 amu. Dan diduga pada P3 tersebut terjadi penambahan atom O (oksigen).
ix
BIOTRANSFORMATION OF PALMATINE BY ENDOPHYTIC FUNGI FROM AKAR KUNING PLANT (Arcangelisia flava L. Merr :
MENISPERMACEAE)
x
Halaman Judul ………. Lembar Persetujuan Proposal Skirpsi... Lembar Pengesahan... BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ... 1.2 Perumusan Masalah... 1.3 Tujuan Penelitian... 1.4 Hipotesis... 1.5 Manfaat Penelitian... 1.6 Batasan Penelitian... BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Akar Kuning
2.1.1 Klasifikasi...
2.2.1 Definisi dan Perkembangan Mikroba endofit... 2.2.2 Isolasi Jamur Endofit... 2.2.3 Metabolit-Metabolit dari Mikroba Endofit... 2.3 Biotransformasi... 2.4 Palmatin... BAB III KERANGKA KONSEP ...
xi
4.1 Waktu dan Tempat Penelitian... 4.2 Alat dan Bahan... 4.3 Metode Penelitian... 4.4 Prosedur Kerja
4.4.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava L. Mer) ... 4.4.2 Biotransformasi Palamatin oleh Jamur AFKR-3.... 4.4.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur
AFKR-3... 4.4.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin oleh
Jamur AFKR-3 pada Medium PDB... 4.4.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin oleh
Jamur AFKR-3 (Ekstrak
diklorometan-metanol)... 4.4.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi
Palmatin oleh Jamur AFKR-3... 4.4.7 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)... 4.4.8 Karakterisasi Produk Biotransformasi... BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari
Arcangelisia flava L. Mer... 5.2 Biotransformasi Palamatin oleh jamur AFKR-3... 5.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3 5.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin... 5.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin... 5.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi... 5.7 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)... 5.8 Karakterisasi Produk Biotransformasi... BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN
xii
Halaman 1. Tabel 1. Nilai Rf fraksi 1 setelah di KLT preparatif
dengan etilasetat: isopropanol : amoniak 25% (8:8:1)... 2. Tabel 2. Produk biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3
pada medium PDB (Potato Dextro Broth ) setelah diisolasi dan dipurifikasi... 3. Tabel 3. Komposisi Medium Potato Dextro Broth (PDB)………... 4. Tabel 4. Komposisi Medium Agar……….... 5. Tabel 5. Komposisi Medium Potato Dextro Agar (PDA)………
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Gambar 1. Batang dan daun Akar Kuning………....
2. Gambar 2. Reaksi Biotransformasi Kuinin oleh jamur Xylaria sp………… 3. Gambar 3. Struktur Molekul Palmatin ………...……….. 4. Gambar 4. Profil Kromatogram KLT Palmatin……….... 5. Gambar 5. Profil Kromatogram HPLC Palmatin ………. 6. Gambar 6. Hasil Spektroskopi Massa Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr.. 7. Gambar 7. Jamur AFKR-3 pada medium PDA setelah berumur 4 hari…... 8. Gambar 8. Profil kromatogram KLT ekstrak dikrorometan:metanol (5 :1) 9. Gambar 9. Kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB ... 10.Gambar 10. Profil Kromatogram HPLC ekstrak diklorometan:metanol
(5:1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB
setelah 1 dan 2 minggu... 11.Gambar 11. Profil Kromatogram KLT ekstrak diklorometan : metanol
(5:1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB
setelah 2 minggu... 12.Gambar 12. Hasil isolat ekstrak metanol dengan kromatografi
kolom sistem isokratik………... 13.Gambar 13. Profil kromatogram KLT ekstrak metanol fraksi 1 dan 2... 14.Gambar 14. Profil kromatogram KLT preparatif ekstrak metanol fraksi 1... 15.Gambar 15. Hasil analisis spektroskopi massa
xiv
Halaman 1. Lampiran 1. Tabel Komposisi Medium
1.1Medium PDB (Potato Dextro Broth)……….
1.2Medium Agar ………
1.3Medium PDA (Potato Dextro Agar)………. 2. Lampiran 2. Skema Kerja
2.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr
2.1.1 Analisis KLT………. 2.1.2 Analisis HPLC………... 2.1.3 Analisis MS……… 2.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3……… 2.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh
Jamur AFKR-3……… 2.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi…...………... 2.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi.……… 2.6 Fraksinasi, Purifikasi dan Karakterisasi
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Mikroba endofit belakang ini memiliki peranan yang cukup penting
dalam bidang bioteknologi, karena kemampuannya dalam menghasilkan
metabolit sekunder yang dapat digunakan sebagai bahan baku obat. Telah
banyak riset yang menunjukan peranan bioteknologi dalam budidaya,
multiplikasi, rekayasa genetika, dan skrining mikroba endofit yang dapat
menghasilkan metabolit sekunder yang sangat penting dalam rangka
pengembangan bahan obat yang berasal dari tanaman obat ini. (Radji, 2005).
Salah satu contoh produksi metabolit sekunder yang telah dilaporkan adalah
produksi dua metabolit bisanthraquinone yaitu episitoskirin dan bislunatin
dalam medium cair Potato Dextrose Broth (PDB) yang dihasilkan oleh
jamur endofit Diaporthe sp. (Agusta. et al, 2006). Dan masih banyak
metabolit lain yang memiliki aktivitas farmakologi yang cukup baik yang
dapat dihasilkan oleh mikroba endofit.
Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit
sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat
besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari
mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Dari sekitar
300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing
tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari
bakteri dan jamur (Strobel. et.al. 2003). Sehingga apabila endofit yang
diisolasi dari suatu tanaman obat dapat menghasilkan alkaloid atau
metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah
yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya untuk
diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan besar memerlukan puluhan
tahun untuk dapat dipanen.
Disamping dapat menghasilkan suatu metabolit sekunder, mikroba
endofit juga mampu mentransformasi senyawa metabolit sekunder menjadi
senyawa baru yang memiliki kerangka dasar yang mirip atau derivat dari
metabolit yang ditransformasi. Proses tersebut dinamakan proses
biotransformasi, dimana suatu mikroba endofit dengan kemampuan
enzimatiknya dapat mengubah suatu metabolit sekunder menjadi produk
baru. Proses ini dapat dilakukan dengan penambahan suatu substrat ke
dalam kultur jamur, dimana substrat yang digunakan adalah senyawa aktif
atau senyawa metabolit sekunder yang ingin dibiotransformasi. Jamur
tersebut dapat mengubah substrat menjadi senyawa baru atau dapat
mengubah suatu senyawa tidak bermanfaat menjadi senyawa yang
bermanfaat. Beberapa penelitian mengenai biotransformasi telah dilakukan
diantaranya biotransformasi 5 buah senyawa flavan oleh jamur Diaporthe sp
yang diisolasi dari tumbuhan teh / Camelia sinensis (Agusta. et al, 2005),
Biotransformasi kuinin oleh jamur endofit Xylaria sp yang diisolasi dari
tumbuhan kina (Shibuya. et al, 2003). Hal tersebut merupakan bukti bahwa
jamur endofit dapat mengubah komponen kimia dari tumbuhan inangnya.
Proses biotransformasi mulai dikembangkan untuk menghasilkan
suatu metabolit baru yang diharapkan memiliki kemampuan lebih
dihasilkan dari suatu tanaman, selain memiliki efek farmakologi yang baik,
juga memiliki berbagai kelemahan diantaranya dari segi farmasetik yang
kurang baik seperti kestabilan, sifat fisikokimia yang buruk. Terkadang zat
aktif yang di duga memiliki efek terapi yang baik biasanya juga memiliki
efek toksik yang cukup tinggi. Dari alasan-alasan tersebut maka suatu
metabolit sekunder yang telah ada dapat dimodifikasi menjadi suatu
metabolit lain yang diharapkan memiliki sifat atau keunggulan
dibandingkan dengan metabolit awalnya.
Tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr) merupakan
salah satu jenis tanaman yang memiliki aktivitas farmakologi yang sudah
sejak lama digunakan untuk obat secara tradisional. Salah satu
penggunaannya adalah untuk obat diare dan malaria . Di Indonesia
tumbuhan ini banyak terdapat di Kalimantan, Sumatera dan Jawa. Metabolit
sekunder yang dimiliki oleh tumbuhan ini , salah satunya adalah senyawa
alkaloid. Pada penelitian terdahulu, telah diisolasi alkaloid dari Arcangelisia flava L. Merr yang meliputi enam senyawa alkaloid kuartener yaitu thalifedine, dehydrocorydalime, pcynarrhine, berberin, palmatin, dan
jatrorrhizine serta tiga senyawa alkaloid tersier (Verpoote , 1982).
senyawa lain maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Dalam penelitian ini , dilakukan pengujian biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 dan dilihat apakah jamur tersebut mampu mengubah senyawa palmatin menjadi senyawa baru turunannya.
1.2. Perumusan Masalah
Apakah jamur endofit AFKR-3 yang diisolasi dari tumbuhan
Arcangelisia flava L. Merr dapat melakukan biotransformasi terhadap senyawa palmatin, sehingga dapat mengubah stuktur kimia senyawa tersebut menjadi senyawa lain turunannya? Kondisi apa yang cocok untuk melakukan proses biotransformasi ini serta bagaimanakah struktur kimia produk yang dihasilkan?
1.3. Tujuan Penelitian
1. Melakukan biotransformasi senyawa palmatin oleh jamur endofit AFKR-3 yang diisolasi dari tumbuhan Arcangelisia flava.L. Merr 2. Mengetahui kondisi yang cocok bagi jamur AFKR-3 tersebut untuk
melakukan proses biotransformasi terhadap senyawa palmatin.
1.4. Hipotesis
Isolat jamur endofit dari Arcangelisia flava L. Merr (AFKR-3) dapat mengubah atau melakukan transformasi terhadap senyawa palmatin menjadi produk turunannya dalam suatu medium yang cocok .
1.5. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa :
1. Pengetahuan tentang tahapan biotransformasi senyawa palmatin oleh jamur
endofit AFKR-3 yang diisolasi dari Arcangelisia flava L. Merr
2. Informasi mengenai kondisi yang cocok agar reaksi biotransformasi palmatin oleh jamur endofit tersebut dapat berjalan.
3. Informasi mengenai produk – produk hasil biotransformasi yang dihasilkan
oleh jamur endofit dari Arcangelisia flava L. Merr tersebut.
1.6. Batasan Penelitian
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava L. Merr)
Gambar 1.Batang dan Daun Akar Kuning
(Sumber:
2.1.1. Klasifikasi
Klasifikasi tumbuhan akar kuning adalah sebagai berikut: Sub Kingdom : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub kelas : Magnoliidae Ordo : Ranunculales
Famili
Genus
Spesies : Arcangelisia flava L. Merr
2.1.2. Nama daerah
Sunda : Aruey ki koneng Jawa : Oyod sirawanan, Peron Minahasa : Uwas
Halmahera : Gumi modoku Malaysia : Mebgkunyit Philipina : Abutra, Suma
Thailand : Khamin kruea, Kamphaeng jedchunum (Mandia, et al. 1999)
2.1.3. Sinonim
Arcangelisia lemniscata (Miers) Becc, Arcangelisia loureiri (Pierre) Diels
2.1.4. Deskripsi
2.1.5. Kegunaan
Di Indonesia, akar kuning banyak digunakan untuk obat penurun demam dan obat sariawan. Di Thailand, batang akar kuning digunakan sebagai obat saluran cerna dan bunganya digunakan sebagai obat disentri. Di Malaysia, dekok dari batang akar kuning digunakan sebagai obat penurun panas, obat cacing serta obat saluran cerna. Di Philipina, penggunaan akar kuning sebagai antiseptik telah banyak digunakan, selain itu dekok dari batang akar kuning juga digunakan untuk ekspektoran, tonik, obat iritasi lambung serta penyakit saluran cerna lainnya. (Mandia, et al, 1999). Setelah dilakukan beberapa pengujian, terbukti bahwa ekstrak Arcangelisia flava L. Merr ini memiliki kemampuan sebagai antimikroba yang cukup baik. Selain itu ekstrak tersebut juga mampu memberikan aktivitas antioksidan yang cukup baik serta memiliki aktivitas antisitotoksik yang baik pula. (Keawprabud, 2005).
2.1.6. Kandungan kimia
Arcangelisia flava L. Merr yang merupakan famili dari Menispermaceae ini diketahui mengandung campuran alkaloid benzylisoquinoline, yang secara biosintesis diperoleh dari asam amino phenilalanin atau tirosin (Mandia, et al. 1999). Pada batang tanaman
macam senyawa alkaloid tersier yaitu hidroksi-berberin, limasin, dan homoarmulin. (Verpoote et al. 1982). Dan terdapat pula tujuh senyawa furanoditerpen juga telah diisolasi dari batang kayu kuning yang meliputi 6-hydroxyarcangelisin, 2-dehidroarcangelisinol, tinophylol, 6-hydroxyfibleucin, 6-hydroxyfibraurin, dan fibleucin. (Kunii. , et al .1995)
2.2Mikroba Endofit
2.2.1 Definisi dan Perkembangan Mikroba Endofit
Endofit berasal dari bahasa Yunani, ‘endo’berarti di dalam dan ‘fit’ (phyte) berarti tumbuhan. Petrini (1991) mendefinisikan endofit sebagai koloni organisme hidup tanpa menimbulkan symptom pada jaringan internal inangnya, walaupun pada periode tertentu akan berakibat timbulnya penyakit. Definisi tersebut lebih memperlihatkan bahwa endofit hanyalah sebagai salah satu tahapan dalam proses infeksi makhluk hidup terhadap inang tanpa pembatasan tipe interaksi yang mungkin terjadi pada endofit dan inangnya.
tidak akan menimbulkan efek negatif terhadap inangnya, sebaliknya malah akan memberikan manfaat. (Agusta .2009)
Menurut Tan RX dan WX. Zou , mikroba endofit adalah mikroba
yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu
hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa
membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat
mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan
senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat
koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman
inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan, et.al. 2001).
2.2.2 Isolasi jamur Endofit
Pada umumnya jamur endofit diisolasi dari organ tumbuhan yang
masih segar dan telah disterilkan permukaannya. Untuk sterilisasi
permukaan organ tumbuhan yang umum digunakan adalah dengan cara
merendamnya dalam alkohol (70%-95%). Namun, kemampuan alkohol
untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan tersebut memiliki
spektrum yang sempit dan sangat terbatas, sehingga perlu dikombinasikan
dengan bahan kimia lainnya. Bahan kimia yang sering dikombinasikan
biasanya adalah natrium hipoklorit (NaOCl). (Zang ,et al. 2006 ; Agusta.
2009).
Medium tumbuh untuk proses isolasi jamur akan berpengaruh
terhadap jumlah dan jenis jamur yang akan diisolasi. Agusta et al (2006),
medium corn meal malt agar (CMMA) dengan antibiotik kloramfenikol dan telah dilaporkan terdapat 6 jenis jamur endofit yang diperoleh.
Sedangkan pada proses isolasi dengan menggunakan medium agar dan
tanpa penambahan antibiotik diperoleh 2 jenis jamur yang berbeda. Pada
medium agar, khamir atau yeast juga memperlihatkan pertumbuhan yang
sangat lambat sehingga dapat digunakan untuk purifikasi isolat jamur yang
tercampur dengan khamir. (Agusta , 2009).
Berikut ini merupakan contoh tahapan isolasi jamur endofit yang
dilakukan oleh Agusta et al,( 2006) dari ranting muda tanaman teh :
1. Organ tumbuhan tertentu (ranting) dicuci bersih dengan air dan
kemudian dipotong-potong dengan ukuran panjang tertentu.
2. Dilakukan sterilisasi terhadap ranting yang telah dipotong dengan
merendamnya dalam etanol 75% selama 1 menit, dalam larutan
natrium hipoklorit selama 0.5 menit dan direndam kembali dengan
etanol 75% selama 0.5 menit.
3. Ranting yang telah disterilisasikan selanjutnya dibelah dengan
menggunakan pemotong steril.
4. Potongan ranting kemudian diletakan diatas medium CMMA yang
mengandung kloramfenikol (0.5 mg/ ml)
5. Koloni-koloni yang telah tumbuh selanjutnya dipisahkan dengan
2.2.3 Metabolit – Metabolit yang Dihasilkan Jamur Endofit.
Berbagai jenis endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya,
dan telah berhasil dibiakkan dalam media perbenihan yang sesuai.
Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikroba endofit
tersebut telah berhasil diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi
struktur molekulnya. Beberapa diantaranya adalah :
1. Mikroba endofit yang menghasilkan antibiotika
Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan oleh mikroba
endofit Cryptosporiopsisquercina yang berhasil diisolasi dari tanaman
obat Tripterigeum wilfordii, dan berhasiat sebagai antijamur yang
patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp.
(Strobel et.al. 1999).
Jenis endofit lainnya yang juga menghasilkan metabolit yang
memiliki aktivitas antibiotika berspektrum luas adalah jamur endofit
yang diisolasi dari rhizome Acorus calamus , yaitu jamur Fusarium
oxysporum . Selain memiliki kemampuan sebagai antibakteri metabolit yang dihasilkan juga memiliki kemampuan sebagai anti jamur. (Barik,
et al. 2010)
2. Mikroba endofit yang menghasilkan metabolit sebagai antikanker
Paclitaxel dan derivatnya merupakan zat yang berkhasiat sebagai
antikanker yang pertama kali ditemukan yang diproduksi oleh mikroba
endofit. Paclitaxel merupakan senyawa diterpenoid yang didapatkan
dalam tanaman Taxus. Senyawa yang dapat mempengaruhi molekul
diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis microspora, yang diisolasi dari
tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia, dan T. wallichiana. Saat ini
beberapa jenis endofit lainnya telah dapat diisolasi dari berbagai jenis
Taxus dan didapatkan berbagai senyawa yang berhasiat sebagai anti
tumor. Demikian pula upaya untuk sintesisnya telah berhasil dilakukan
(Strobel. et.al. 2002).
3. Mikroba endofit penghasil zat anti malaria
Colletotrichum sp. Merupakan endofit yang diisolasi dari tanaman
Artemisia annua, menghasilkan metabolit artemisinin yang sangat
potensial sebagai anti malaria (Lu H., et.al. 2000). Disamping itu
beberapa mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman Cinchona spp,
jugamampu menghasilkan alkaloidcinchona yang dapat dikembangkan
sebagai sumber bahan bakuobat anti malaria (Simanjuntak,et.al. 2002).
4. Endofit yang memproduksi antioksidan
Pestacin dan isopestacin merupakan metabolit sekunder yang
dihasilkan oleh endofit P.microspora. Endofit ini berhasil diisolasi dari
tanaman Terminalia morobensis, yang tumbuh di Papua New Guinea.
Baik pestacin ataupun isopestacin berhasiat sebagai antioksidan, dimana
aktivitas ini diduga karena struktur molekulnya mirip dengan flavonoid
2.3 Biotransformasi
Biotransformasi adalah proses yang dilakukan oleh mikroorganisme atau enzim untuk merubah suatu senyawa menjadi suatu produk dengan kerangka dasar yang mirip. Reaksi yang terjadi dikatalis oleh enzim yang dihasilkan oleh sel mikroba. Kebanyakan enzim tersebut dibutuhkan untuk fungsi normal dalam kehidupan mikroba seperti metabolisme dan reproduksi. (Rosazza, 1982). Biotransformasi ini digunakan pada banyak kasus untuk meningkatkan aktivitas biologik dari suatu struktur kimia dan biasanya melibatkan aksi dari salah satu atau beberapa enzim yang digabungkan dalam sequence untuk melakukan suatu reaksi kimia khusus. (Surodjo, 2008). Agar proses biotransformasi dapat berhasil, diperlukan berbagai persyaratan diantaranya kultur harus mempunyai enzim utama untuk mengubah dari prekusor ke produk. Produk yang dibentuk harus lebih cepat untuk menghindari dimetabolisme lebih lanjut, dan kultur harus toleransi dengan substrat yang ditambahkan juga produk yang dihasilkan.
Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa suatu mikroba endofit dapat melakukan proses biotransformasi metabolit sekunder yang ada pada tanaman inangnya, diantaranya adalah :
• Fungi endofit Xylaria sp. yang diisolasi dari Chincona pubescence
dilaporkan dapat mengubah alkaloid kina menjadi turunan
1-N-oksida yang memiliki efek sitotoksik lebih rendah dibanding
melibatkan reaksi oksidasi yang menggunakan molekul oksigen yang dikatalisasi oleh endoenzim (Shibuya, et al . 2002).
Gambar 2. Reaksi biotransformasi kuinin oleh jamur endofit Xylaria sp yang diisolasi dari tumbuhan kina.
• Lima senyawa yang telah diisolasi dari tumbuhan teh (Camelia sinensis) yaitu katekin, epikatekin, epikatekin 3 O-gallate, epilokatekin 3-O-gallate, dan galokatekin dapat mengalami biotransformasi oleh jamur endofit Diaporthe sp. Salah satu contohnya adalah senyawa (+)- catechin yang mengalami stereoselektif oksidasi pada posisi C-4, berubah menjadi (+)-(2R,3S,4S)-3,4,5,7,3’,4’ hexahydroxyflavan. (Agusta, et al. 2005).
• Senyawa (+)-epigalokatekin-3-O-gallat dilaporkan dapat mengalami biotransformasi menjadi (-)-2R,3S-Dihidromirisetin oleh fungi
endofit Diaporthe sp yang diisolasi dari tumbuhan teh. Proses
biotransformasi tersebut terjadi melalui tiga tahapan reaksi.Reaksi
tahap pertama adalah reaksi hidrolisis untuk melepaskan gugus
galoil menjadi (-)- GCG (galokatekin galat) dan asam galat. Reaksi
tahap kedua adalah reaksi oksidasi gugus metilen C-4 menjadi
4-hidroksi untuk menghasilkan produk minor. Dan pada reaksi tahap
ketiga terjadi reaksi oksidasi lanjutan pada atom C-4 untuk
kuinin Kuinin 1-N-Oksida
membentuk gugus karbonil sehingga menghasilkan
(-)-(2R,3S)-dihidromirisetin. (Agusta. 2007)
Reaksi biotransformasi oleh jamur endofit adalah unik dan spesifik. Salah satu contohnya adalah reaksi biotransformasi yang terjadi pada (+)-epigalokatekin-3-O-gallat oleh jamur Diaporthe sp, dimana pada peningkatan suhu inkubasi sampai 30°C tidak menghasilkan produk (-)-2R,3S-dihidromirisetin. Akan tetapi jika suhu diturunkan sampai 10°C ,
reaksi dapat berlangsung dan menghasilkan produk. Selain itu factor
cahaya juga sangat berpengaruh terhadap reaksi biotransformasi tersebut.
Pada kondisi ruangan yang terang pada siang hari reaksi biotransformasi
tidak berlangsung, karena reaksi tersebut berjalan pada kondisi gelap.
(Agusta, 2007). Contoh lain yang menunjukan bahwa reaksi
biotransformasi itu adalah spesifik adalah yang diperlihatkan oleh jamur
endofit Diaporthe sp yang hanya bisa melakukan biotransformasi senyawa
katekin alami yang terdapat pada tumbuhan inangnya. Karena turunan
katekin dengan konfigurasi 2S- fenil yang merupakan senyawa artefak
yang bukan komponen kimia alami teh, tidak menunjukan berlangsungnya
reaksi biotransformasi. (Agusta , et al. 2005).
Pada proses biotransformasi, jamur endofit berperan sebagai katalis
dimana jamur akan mengeluarkan suatu enzim yang dapat merubah
struktur suatu senyawa kimia. Enzim akan bekerja baik apabila jamur
endofit tersebut mendapatkan nutrisi yang baik pula. Sehingga pemilihan
medium yang cocok sangat mempengaruhi proses biotransformasi
pertumbuhan jamur pun akan baik dan dapat berpengaruh terhadap
produksi enzim yang dihasilkannya.
Selain itu penambahan substrat juga mempengaruhi jalanya reaksi
biotransformasi. Contohnya pada biotransformasi kina oleh jamur Xylaria
sp tidak berjalan dan tidak menghasilkan produk biotransformasi dengan
penambahan substrat yang sekaligus banyak (20 mg). Sebaliknya substrat
yang ditambahkan secara bertahap dari jumlah yang sedikit (2mg)
kemudian beberapa hari kemudian ditambahkan lagi sebanyak 20 mg,
memperlihatkan jalannya reaksi biotransformasi (Shibuya, 2003).
Sehingga agar proses biotransformasi dapat berjalan maka perlu dicari
kondisi yang cocok untuk jamur tersebut, karena pada dasarnya setiap
jamur memiliki karakter yang spesifik dan unik untuk dapat melakukan
reaksi biotransformasi.
2.4 Palmatin
Gambar 3. Struktur Molekul Palmatin
BAB III
KERANGKA KONSEP
Dilakukan penelitian mengenai biotransformasi senyawa palmatin tersebut
oleh isolat jamur AFKR-3 dari tumbuhan Arcangelisisa flava L.Merr yang
sebelumnya telah diketahui mampu melakukan biotransformasi berberin.
Medium tumbuh jamur (medium PDB)
Identifikasi senyawa F-4 yang diduga merupakan senyawa palmatin yang sebelumnya telah diisolasi dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L.Merr )
Isolat jamur AFKR-3 pada medium PDA yang berumur 4 hari
Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3
Scaling up biotransformasi palmatin
Penyiapan metode penelitian, alat serta bahan yang akan digunakan
Senyawa palmatin yang
diisolasi dari Arcangelisia
flava L . Merr
Ekstraksi, Partisi, Fraksinasi , Purifikasi dan Karakterisasi Hasil Biotransformasi
Analisa Data
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2010 hingga bulan Juni 2010 bertempat di Laboratorium Fitokimia, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.
4.2 Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain Rotary Evaporator, Syringe Driven Filter Unit (Miller GP) ukuran 0.22 µm,
test tube mixer (Vortex Sibata), vial, UV cabinet, chamber, petridish, , lemari asam, neraca analitik, Laminar Air Flow (LAF), pipa kapiler, autoklaf, micropipet, tabung reaksi, rak tabung reaksi, shaker, pipet tetes, gelas ukur, beker glass, vial, ampul, mikrotiter plate, kromatografi kolom, erlenmeyer, inkubator shaker, refrigerator, HPLC (Shimadzu LC-20 ab), LCMS (LCT Premier XE).
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat senyawa alkaloid Arcangelisia flava L. Merr (palmatin), isolat jamur AFKR-3, plat TLC (TLC silica gel 60 F254), sephadex LH-20, metanol, diklorometan, asam asetat glasial, reagen dragendorf, vanilin, amoniak 25%, Ce(SO4)2, aquades, isopropanol, etil asetat, n-hexan, metanol
90%, etanol 70%, asetonitril, air miliphore, aquabides, larutan dimetil sulfoksida, (DMSO), medium Potato Dextro Broth (PDB), medium
Potato Dextro Agar (PDA).
4.3 Metode Penelitian
Kegiatan yang dilakukan untuk mencapai sasaran :
1. Penyiapan alat dan bahan yang akan digunakan 2. Identifikasi Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr 3. Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3
4. Scaling up biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 5. Ekstraksi hasil biotransformasi
6. Partisi ekstrak hasil biotransformasi
7. Fraksinasi ekstrak hasil biotransformasi dengan kromatografi kolom 8. Purifikasi fraksi hasil biotransformasi dengan TLC preparatif
9. Karakterisasi senyawa hasil biotransformasi dengan spektoskopi massa
4.4 Prosedur Kerja
4.4.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Akar Kuning
(Arcangelisia flava L. Merr)
dahulu dipreparasi untuk mendapatkan palmatin bebas. Palmatin HCl dilarutkan dengan diklorometan : air (1:1) kemudian ditambahkan NH4OH, dikocok dan didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan diklorometan diambil dan dipekatkan. Selanjutnya ekstrak diklorometan dan fraksi 4 dari Arcangelisia flava. L. Merr dianalisis dengan KLT, dimana fase gerak yang digunakan adalah diklorometan : metanol (6 : 1) dengan penambahan 1 tetes asam asetat glasial. Untuk analisis HPLC, kolom yang digunakan adalah Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm. Dan untuk analisis dengan spektoskopi massa digunakan LCMS LCT Premier XE.
4.4.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
Dalam penelitian ini strain jamur yang digunakan adalah salah satu isolat jamur filament yang sebelumnya telah diisolasi dari akar kuning
Arcangelisia flava (L) Merr yaitu jamur AFKR-3. 1. Pembuatan Medium Kultivikasi
2. Kultivasi Jamur Endofit
Isolat jamur AFKR-3 yang telah ditumbuhkan pada medium Potato Dextro Agar /PDA dipotong kecil dengan ukuran kurang lebih 0.5 x 0.5 cm sebanyak 4 buah. Kemudian jamur tersebut dipindahkan ke dalam medium PBD (Potato Dextro Broth) yang sebelumnya telah disterilkan dan didinginkan. Kultivasi jamur endofit ini di kerjakan dalam LAF (Laminar Air Flow) . Medium PDB yang telah berisi jamur endofit tersebut kemudian dishaker pada temperatur 27°C dengan kecepatan 120 rpm.
3. Penambahan Substrat pada Kultur
Selanjutnya kultur jamur dan substrat dishaker pada temperatur 27°C dengan kecepatan 120 rpm.
4. Monitoring Hasil Biotransformasi
Dalam monitoring hasil biotransformasi dilakukan penyamplingan terhadap kultur jamur AFKR-3 yang telah ditambahkan substrat. Sampling pertama dilakukan setelah 24 jam penambahan substrat pada kultur jamurtersebut . Penyamplingan dilakukan dengan memipet 5 ml substrat + kultur yang ada dalam erlenmeyer kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu diekstraksi dengan pelarut dikrlorometan : metanol dengan perbandingan 5:1 sebanyak 5 ml. Selanjutnya campuran tersebut di vortex dan didiamkan beberapa menit hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah kemudian dipipet dan dipindahkan ke labu evap dan diuapkan. Ekstrak kental kemudian di monitoring dengan TLC (absorben : silica gel dan eluen diklorometan: metanol (6:1) dengan penambahan asam asetat glasial 1 tetes. Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm , dan kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf.
4.4.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
1. Pembuatan Medium Kultivasi
dengan karet silikon. Selain itu di buat pula medium PDB untuk kontrol . Keenam erlenmeyer tersebut kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121 °C selama 20 menit.
2. Kultivasi Jamur Endofit AFKR-3
Isolat jamur AFKR-3 yang telah ditumbuhkan pada medium PDA ( Potato Dextro Agar ) dipotong kecil dengan ukuran kurang lebih 0.5 x 0.5 cm sebanyak 4 buah. Kemudian jamur tersebut dipindahkan ke dalam 6 erlenmeyer yang berisi medium PDB yang sebelumnya telah disterilkan dan didinginkan . Pengerjaan kultivasi ini dilakukan dalam keadaan steril di LAF (Laminer Air Flow). Medium PDB yang telah berisi jamur endofit kemudian dishaker pada temperatur 27 °C dengan kecepatan 120 rpm.
3. Penambahan Substrat pada Kultur
Substrat yang ditambahkan adalah senyawa palmatin. Penambahan substrat dilakukan bertahap sebanyak 2 kali, penambahan yang pertama dilakukan setelah jamur berumur 1 hari setelah kultivasi. Sedangkan penambahan substrat yang kedua dilakukan setelah 4 hari kultivasi. Substrat di tambahkan pada kelima erlemeyer yang telah berisi medium dan jamur, sedangkan untuk medium kontrol tidak diberikan substrat. Substrat yang ditambahkan harus dalam keadaan steril, sehingga dilakukan filtrasi menggunakan Syringe Miller GP
kemudian masing-masing dimasukan ke dalam kultur jamur endofit. Dan untuk penambahan substrat yang kedua, sebanyak 20 ml substrat mg (1 mg / mL metanol ) dipipet dan dimasukan ke dalam kultur jamur. Kemudian keenam erlenmeyer tersebut dishaker kembali pada temperatur 27 °C dengan kecepatan 120 rpm.
4. Monitoring Hasil Biotransformasi
4.4.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
pada medium PDB (Potato Dextro Broth)
4.4.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin oleh Jamur
AFKR-3 (Ekstrak Diklorometan-Metanol)
Partisi ekstrak dilakukan dengan corong pisah dengan melarutkan ekstrak pekat diklorometan:metanol dengan metanol . Selanjutrnya larutan metanol tersebut ditambahkan dengan sejumlah n-hexan, untuk kemudian dipartisi dalam corong pisah. Campuran tersebut dikocok dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah (lapisan metanol) diambil dan di pekatkan. Ekstrak pekat metanol kemudian di KLT kembali (absorben : silica gel dan eluen diklorometan-metanol = 6 : 1 yang ditambahkan 1 tetes asam asetat glasial).
4.4.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi Palmatin
oleh Jamur AFKR-3
4.4.7 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)
Dalam tahapan ini, fraksi 1 dipurifikasi dengan menggunakan KLT preparatif (adsorben : silica gel 60 F245 dengan eluennya etil asetat : isopropanol : amoniak 25 % = 8 : 8 : 5 ). Selanjutnya noda yang muncul diamati dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Setelah itu noda yang muncul itu dikerok kemudian dilarutkan dengan diklorometan, metanol, dan kloroform, lalu disaring dengan menggunakan kertas saring. Hasil yang diperoleh dikeringkan dan kemudian di KLT dengan eluen etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8:8:1). Noda yang muncul diamati dan disemprot dengan reagen dragendorf serta dihitung nilai Rf-nya.
4.4.8 Karakterisasi Senyawa Hasil Biotransformasi
BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr
Dari penelitian sebelumnya telah diisolasi beberapa senyawa alkaloid dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr). Salah satu alkaloidnya adalah fraksi 4 yang diduga merupakan senyawa palmatin (Mahesa, 2009). Pada penelitian ini terlebih dahulu dilakukan identifikasi terhadap senyawa fraksi 4 tersebut. Identifikasi fraksi 4 dilakukan dengan analisis KLT dan HPLC serta dengan spektroskopi massa. Identifikasi dengan KLT dan HPLC dilakukan dengan membandingkan senyawa fraksi 4 dengan standar palmatin HCl. Sedangkan untuk analisis dengan spektroskopi massa, bobot molekul fraksi 4 yang diperoleh dibandingkan dengan senyawa palmatin standar yang memiliki bobot molekul m/z 352.4 (Chen, et al. 1999).
Dari profil kromatogram KLT dapat dilihat bahwa standar palmatin dan fraksi 4 memiliki spot dengan nilai Rf yang sama yaitu 0.36 . Dan gabungan senyawa fraksi 4 dengan standar palmatin HCl menghasilkan satu spot
(Gambar 4). Hal itu mengindikasikan bahwa kedua senyawa tersebut adalah senyawa yang sama. Dari hasil kromatrogram HPLC, peak yang muncul pada standar palmatin HCl dan fraksi 4 Arcangelisia flava L. Merr memiliki waktu retensi yang hampir sama yaitu pada 5.460 dan 5.456 (Gambar 5). Kedua analisis tersebut diperkuat dengan analisis spektroskopi massa, dimana dari hasil analisis tersebut diperoleh bobot molekul senyawa fraksi 4 kurang lebih adalah sama dengan standar palmatin yaitu sebesar m/z 352.14 (Gambar 6).
Gambar 4. Profil kromatogram KLT palmatin . Fasa diam = silica gel, eluen = diklorometan : metanol (6 : 1 ) dengan penambahan asam asetat glasial 1 tetes. 1 = pada panjang gelombang 254 nm, 2 = pada panjang gelombang 366 nm, 3 = setelah disemprot pereaksi dragendorf. a = standar palmatin, b=campuran F4+standar, c= F4 A.Flava.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
Gambar 5. Profil Kromatogram HPLC palmatin. Kolom = Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor pada panjang gelombang = 266 nm. A= palmatin HCl , B = Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr.
Gambar 6. Hasil analisis spektroskopi massa (LCMS LCT Premier XE) fraksi 4
Arcangelisia flava L.Merr dengan metode direct inlet.
Dari hasil ketiga analisis diatas dapat dipastikan bahwa senyawa fraksi 4 yang telah diisolasi dari tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr tersebut merupakan senyawa palmatin.
5.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
Jamur endofit AFKR-3 yang diperoleh dari tumbuhan
Arcangelesia flava L. Merr telah diketahui dapat melakukan proses biotransformasi terhadap senyawa berberin di dalam medium cair (Mahesa, 2009). Dalam penelitian ini, dilakukan serangkaian penelitian untuk mengetahui apakah jamur endofit AFKR-3 dapat melakukan biotransformasi terhadap senyawa alkaloid tumbuhan Arcangelisia flava
L.Merr lainnya, yaitu palmatin. Isolat jamur AFKR-3 yang akan digunakan adalah jamur yang telah diremajakan dan berumur 3-4 hari pada medium PDA (Potato Dextro Agar).
Hasil pengamatan secara makroskopis memperlihatkan bahwa jamur endofit AFKR-3 memiliki miselium berwarna putih jika ditumbuhkan pada medium PDA, seperti terlihat pada Gambar 7. Sedangkan pada bagian belakang, koloni jamur ini memperlihatkan warna kuning yang mulai terbentuk beberapa hari setelah ditanam. Kemungkinan warna kuning ini muncul akibat ada produksi metabolit oleh jamur tersebut.
Gambar 7. Jamur AFKR – 3 yang diisolasi dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr ) yang ditanam pada medium Potato Dextro Agar (PDA) setelah berumur 4 hari.
Prosedur dalam penambahan substrat pada penelitian ini, mengacu pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Shibuya et al (2005 ), dimana substrat yang ditambahkan dilakukan secara bertahap. Sejumlah substrat ditambahkan dalam jumlah yang sedikit setelah jamur berumur 1 hari, tiga hari kemudian penambahan substrat dilakukan kembali dalam jumlah yang lebih banyak. Hal itu bertujuan karena umumnya proses biotransformasi berjalan spesifik.
Dalam penelitian yang dilakukan oleh Shibuya (2005) dan Agusta 2010 (data belum dipublikasi), diketahui bahwa penambahan substrat ke dalam kultur jamur dalam jumlah yang sekaligus banyak tidak diperoleh produk biotransformasi atau dalam kata lain reaksi biotransformasi tidak
berjalan. Sebaliknya substrat yang ditambahkan sedikit kemudian banyak memperlihatkan jalannya reaksi biotransformasi. Oleh karena itu dalam penelitian ini dipilih cara penambahan substrat yang secara bertahap dan dilihat apakah proses biotransformasi berjalan atau tidak dengan memonitoring substrat yang dikultur pada jamur AFKR-3 pada medium PDB (Potato Dextro Broth).
Dalam proses monitoring biotransformasi dilakukan penyamplingan terhadap kultur jamur yang telah ditambah substrat setelah 24 jam, 1 minggu dan 2 minggu. Penyamplingan dilakukan dengan mengambil sebanyak 5 ml larutan sampel yang kemudian diekstraksi dengan pelarut diklorometan : metanol (5 : 1). Hasil monitoring dapat diamati dari noda yang muncul pada plat KLT. Pola kromatogram KLT ekstrak reaksi biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 di dalam medium PDB seperti terlihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Profil kromatogram KLT ekstrak diklorometan – metanol (5 :1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB . Fasa diam = silica gel, eluen = diklorometan : metanol : asam asetat glasial = 6 : 1 : 1 tetes. A = hasil KLT setelah 24 jam dari penambahan substrat, B = hasil KLT setelah 1 minggu dari penambahan substrat. C = hasil KLT setelah 2 minggu dari penambahan substrat. a = standar palmatin, b= sampel, c = campuran standar + sampel.
a b
a
b
a
b
a
a
c
b
a
c
b
B
A
C
Hasil monitoring 24 jam setelah penambahan substrat belum menampakan terjadinya proses biotransformasi. Hal itu tampak dari pola kormatogram KLT yang terbentuk, yaitu hanya satu spot yang identik dengan standar. Pada kromatogram KLT hasil analisis ekstrak setelah 1 minggu, terlihat munculnya spot baru di bawah substrat palmatin. Hal ini merupakan indikasi bahwa telah terjadinya proses reaksi biotransformasi palmatin oleh AFKR-3. Akan tetapi spot produk biotransformasi yang terbentuk masih kecil yang mengindikasikan bahwa masih banyak substrat palmatin yang belum dikonversi menjadi produk. Sedangkan pada hasil sampling setelah 2 minggu, pada kromatogram KLT terlihat bahwa spot
produk reaksi biotransformasi sudah tampak jelas dimana spot produk lebih besar dari spot substrat palmatin. Itu berarti dalam waktu 2 minggu, substrat palmatin telah banyak yang dikonversikan menjadi produk biotransformasinya. Dan berdasarkan data di atas itulah diketahui bahwa jamur endofit AFKAR-3 dapat melakukan proses biotransformasi palmatin menjadi suatu produk turunannya.
5.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
untuk penambahan yang kedua (setelah 4 hari kultivasi). Selain itu, dibuat pula kontrol jamur yang tidak ditambahkan substrat sebagai pembandingnya. Untuk pertumbuhan jamur endofit dapat dilihat seperti pada Gambar 9.
Gambar 9. Kultur jamur endofit AFKR-3 pada medium PBD (Potato Dextro Broth) setelah 2 minggu dari penambahan substrat (palmatin). A= kultur jamur + substrat. B = kultur jamur tanpa subtrat (kontrol).
Dalam proses scaling up, dilakukan monitoring biotransformasi dengan KLT dan HPLC untuk lebih memastikan apakah reaksi biotransformasi sudah berjalan. Monitoring pada scaling up dilakukan setelah 1 minggu dari penambahan substrat. Pola kromatogram KLT ekstrak setelah 1 minggu pada monitoring scaling up hampir sama dengan monitoring pada biotransformasi, dimana spot yang terbentuk belum memperlihatkan pemisahan yang jelas dan spot produk yang terbentuk masih sangat sedikit . Sedangkan untuk hasil analisis dengan HPLC dapat dilihat seperti pada Gambar 10.
Dari hasil analisis kromatogram HPLC ekstrak setelah satu minggu dan dua minggu terlihat bahwa telah terjadi penurunan puncak substrat palmatin. Dan dipihak lain bermunculan puncak-puncak baru pada waktu retensi yang berbeda-beda (Gambar 10). Karena sangat terbatasnya jumlah
produk biotransformasi yang berhasil diperoleh, sampai saat ini belum bisa dilakukan verifikasi puncak mana yang merupakan produk hasil proses biotransformasi palmatin.
Gambar 10 . Kromatogram HPLC ekstrak diklorometan-metanol (5 : 1). Kolom = Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor pada panjang gelombang = 266 nm. A = ekstrak setelah 1 minggu penambahan substrat. B = ekstrak setelah 2 minggu penambahan substrat.
5.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin
Pada saat kultur jamur mencapai 2 minggu setelah penambahan substrat yang kedua, seluruh medium dan miselium kultur jamur AFKR-3 dipanen dengan cara melakukan proses ekstraksi. Pelarut yang digunakan dalam
ekstraksi adalah diklorometan : metanol (5 : 1), sama seperti pada sampling biotransformasi. Ekstrak pekat diklorometan-metanol yang diperoleh kemudian di analisis dengan teknik KLT (Gambar 11) dan HPLC (Gambar 10) untuk memastikan produk-produk yang dihasilkan.
Gambar 11. Profil kromatogram KLT ekstrak diklorometan : metanol (5 : 1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB setelah 2 minggu . Fasa diam = silica gel, eluen = diklorometan : metanol : asam asetat glasial = 6 : 1 : 1 tetes. 1 = hasil KLT yang di amati pada 254 dan 366 nm. 2 = hasil KLT setelah disemprot serium. a = standar , b= kultur jamur+substrat , c = kultur jamur tanpa substrat (kontrol).
Dari hasil analisa dengan kromatogram KLT, pada plat KLT terdapat dua spot dimana salah satu spot merupakan spot produk biotransformasi. Selain menghasilkan produk baru yang merupakan turunan dari senyawa palmatin, dalam proses biotransformasi tersebut juga terdapat pula senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan oleh jamur AFKR-3 itu sendiri. Dari profil kromatogram KLT pada 256 nm dan setelah disemprot dengan serium nampak spot-spot yang diduga sebagai asam lemak dan metabolit lain yang lebih polar yang dihasilkan oleh jamur AFKR-3 tersebut . Hal itu diperkuat dari profil kromatogram KLT pada
a
b
a b c
( 1)
b
254 nm
366 nm
(2)
kontrol jamur dimana pada pengamatan dibawah sinar UV 254 nm spot
yang muncul hanya tampak pada bagian atas (non polar) saja dan pada 366 nm terlihat jelas bahwa tidak tampak spot palmatin dan turunannya. Hal itu mengindikasikan bahwa produk biotransformasi yang dihasilkan bukan merupakan hasil metabolit dari kultur jamur AFKR-3 dalam medium PBD, melainkan hasil biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3. Dimana senyawa palmatin dirubah menjadi senyawa lain turunannya oleh suatu enzim yang terdapat pada jamur AFKR-3 tersebut.
Berdasarkan kromatogram analisis HPLC pada sampel setelah 1 minggu dan 2 minggu dapat dilihat banyak peak yang muncul yang mengindikasikan banyaknya metabolit yang dihasilkan (Gambar 10). Diantara peak-peak yang muncul pada sampel diatas, peak senyawa palmatin berada pada waktu retensi 5.426 (sampel setelah 1 minggu), dan 5.418 (sampel setelah 2 minggu). Jiika dibandingkan dengan standar palmatin, pada kromatogram HPLC sampel setelah 1 minggu dan 2 minggu dapat dilihat bahwa peak palmatin mengalami penurunan yang dikarenakan munculnya peak-peak baru. Hal itu mengindikasikan bahwa sejumlah senyawa palmatin telah dikonversikan menjadi produk baru turunannya. Sehingga jumlah senyawa palmatin mengalami penurunan.
5.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin
tersebut. Sehinggga untuk mempermudah proses isolasi, perlu dilakukan partisi terhadap ekstrak pekat diklorometan : metanol tersebut. Ekstrak pekat terlebih dahulu dilarutkan dalam metanol dan kemudian dipartisi dengan n-hexan untuk menarik senyawa-senyawa non polar lainnya.
Dari hasil partisi diperoleh ekstrak pekat n-hexan yang dihasilkan cukup banyak yaitu sekitar 221 mg . Hal itu mengindikasikan bahwa dalam sampel terdapat banyak asam lemak dan senyawa non polar lainnya yang dihasilkan dari kultur jamur pada medium PDB. Sedangkan ekstrak metanolnya hanya 59 mg. Ekstral metanol itulah yang kemudian akan difraksinasi untuk tujuan isolasi dan untuk mempermudah dalam pengamatan senyawa alkaloid yang dihasilkan.
5.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi
Fraksinasi ekstrak metanol dilakukan dengan kromatografi kolom. Dalam proses kromatografi kolom ini, digunakan sistem isokratik dimana sebagai fase diam digunakan sephadex LH 20 dan fase geraknya adalah metanol 90%. Volume kolom sephadex LH 20 sebesar 275 ml. Isolat-isolat yang keluar ditampung dalam tabung reaksi (Gambar 12).
Dari hasil fraksinasi diperoleh 2 fraksi yang merupakan gabungan dari isolat pada tabung 2-5 (Fraksi 1) dan 6-8 (Fraksi 2). Warna fraksi yang muncul berbeda dari bening, kuning muda, kuning pekat hingga coklat bening. Untuk mencari dimana letak senyawa biotransformasi palmatin selain dapat dilihat dari warna senyawa juga dapat diperiksa dengan KLT. Dari pengamatan visual diduga larutan yang berwarna kuning memiliki senyawa-senyawa alkaloid. Sedangkan dari pemeriksaan dengan menggunakan KLT, dapat dilihat dari spot yang muncul. Pada tabung ke 1 dan 9-13 tidak memperlihatkan spot palmatin dan senyawa turunannya. Sedangkan pada isolat tabung 2-8 terdapat spot yang menunjukan senyawa alkaloid tersebut. Dari fraksi 1 (2-5) diperoleh ekstrak pekat sejumlah 9.6 mg sedangkan jumlah ekstrak pekat pada fraksi 2 (6-8) sebesar 13.3 mg. Kedua fraksi tersebut kemudian dianalisis dengan KLT , profil kromatogramnya dapat dilihat seperti pada Gambar 13.
Gambar 13 . Profil kromatogram KLT ekstrak metanol fraksi 1 dan 2 yang di KLT dengan Fasa diam = silica gel, eluen = etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8 : 8 : 5) yang diamati pada UV panjang gelombang 254 nm. Std = standar palmatin , 1 = fraksi 1, 2 = fraksi 2.
std 1 2 std 1
Produk biotransformasi
Dari kromatogram KLT diatas dapat diketahui bahwa, fraksi 1 mengalami pemisahan yang cukup jelas (terdapat 2 spot) , sedangkan untuk fraksi 2 hanya terdapat 1 spot saja. Diduga senyawa pada fraksi 2 merupakan substrat karena spot yang terbentuk memiliki Rf yang sama dengan substrat yaitu sebesar 0.4 . Oleh karena itu, untuk isolasi lebih lanjut dengan KLT preparatif digunakan fraksi 1 saja.
5.6 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)
Untuk memperoleh isolat murni, maka perlu dilakukan purifikasi terhadap hasil biotransformasi. Purifikasi dilakukan dengan menggunakan KLT preparatif, dimana tujuan dari KLT preparatif sendiri adalah untuk isolasi hingga diperoleh senyawa murni. Sebelum dilakukan preparatif, harus dipastikan eluen yang digunakan dalam pemisahan harus cocok, sehingga terjadi pemisahan yang cukup jelas. Dalam KLT preparatif ini ekstrak fraksi 1 di totolkan pada plat KLT dengan ukuran 20 x 10 cm. Dan hasil preparatif dapat dilihat seperti pada Gambar 14.
Gambar 14 . Profil kromatogram KLT preparatif ekstrak metanol fraksi 1 . Fasa diam = silica gel, eluen = etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8:8:5) sejumlah 84 ml yang diamati pada panjang gelombang UV 366 nm.
an bawah
Lapisan atas
Lapisan tengah 1
Dari hasil KLT preparatif diperoleh empat lapisan (atas, tengah 1, tengah 2 dan bawah), keempat lapisan tersebut kemudian di kerok dan masing – masing lapisan diekstrak dengan diklorometan, metanol dan klorofom, tujuan adalah untuk menarik secara sempurna senyawa yang telah dipreparatif. Setelah diperoleh ekstrak pekat dalam masing-masing lapisan tersebut, keempat lapisan tersebut di KLT kembali untuk melihat apakah isolat tersebut sudah benar-benar murni. Dari hasil KLT keempat lapisan diatas diperoleh nilai Rf yang berbeda pada masing-masing lapisan seperti pada Tabel 1.
Tabel 1. Nilai Rf fraksi 1 setelah di KLT preparatif dengan etilasetat: isopropanol : amoniak 25% (8:8:1) .
No Lapisan Rf
1 Palmatin 0.4
2 Atas 0.54
3 Tengah 1 0.50
4 Tengah 2 0.52
5 Bawah 0.4
Dari hasil isolasi pada biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 dalam medium PDB diperoleh AFKR-3 produk biotransformasi dengan nilai Rf serta jumlah yang diperoleh seperti pada Tabel 2.
Tabel 2. Produk biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 pada medium PDB (Potato Dextro Broth ) setelah diisolasi dan dipurifikasi.
No Hasil Biotransformasi Rf Berat (mg)
1 Produk 1 (lapisan atas ) 0.54 1.6 2 Produk 2 (lapisan tengah2) 0.52 1.6 3 Produk 3 (lapisn tengah 1) 0.50 2.1
Jumlah dari ketiga produk yang diperoleh diatas sangat sedikit, hal itu dikarenakan jumlah ekstrak metanol yang dihasilkanya pun sangat sedikit . Dan untuk mendapatkan produk murni perlu dilakukan preparatif hingga diperoleh senyawa tunggal (murni) untuk kemudian dapat dianalisis strukturnya. Produk biotransformasi inilah yang kemudian dianalisis dengan Mass Spektrofotometri.
5.7 Karakterisasi Produk Biotransformasi dengan Spektroskopi Massa
Gambar 15. Hasil analisis spektroskopi massa (LCMS LCT Premier XE) produk 3 dengan metode direct inlet.
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1Kesimpulan
Dari penelitian ini dapat diambil beberapa kesimpulan, yaitu :
1. Jamur endofit AFKR-3 yang diisolasi dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr) memiliki kemampuan dalam melakukan transformasi senyawa palmatin pada medium PDB (Potato Dextro Broth).
2. Senyawa biotransformasi terbentuk setelah 14 hari dari penambahan substrat yang kedua.
3. Dari isolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan KLT preparatif diperoleh 3 produk biotransformasi dengan nilai Rf masing-masing adalah 0.54 (P1 , 1.6 mg ) , 0.52 (P2, 1.6 mg ) dan 0.50 (P3, 2.1 mg)
4. Identifikasi P3 dengan MS memperlihatkan terjadinya penambahan BM (Bobot Molekul) sebanyak 16 amu yang diduga merupakan atom oksigen.
6.2 Saran
1) Perlu dilakukan scaling up dalam jumlah yang lebih besar untuk memperoleh produk yang lebih banyak.
2) Perlu dilakukan analisis lebih lanjut dengan UV, IR, dan NMR untuk mengetahui struktur dari ketiga produk yang dihasilkan.
3) Perlu dilakukan uji aktivitas farmakologi terhadap produk biotransformasi yang dihasilkan serta membandingkannya dengan senyawa asal, untuk mengetahui apakah produk biotransformasi lebih baik dibandingkan senyawa asalnya.
DAFTAR PUSTAKA
Agusta A, Maheara S, Ohashi A, Simanjuntak P, and Shibuya H. 2005.
Stereoselective Oxidation at C-4 of Flavans by the Endophytic Fungus Diaporthe sp. Isolated from a Tea Plant. Chem. Pharm.Bull. 53 : 1565 – 1569.
Agusta A. 2007. Biotransformasi Epigalokatekin-3-O-galat Menjadi (-)-2R,3S-Dihidromirisetin oleh Fungi Endofit Diaporthe sp. Isolat E dari Tumbuhan Teh. HAYATI Journal of Biosciences . p 150-154
Agusta A, Ohashi K, Shibuya H. 2006. Bisanthraquinone metabolites produce by the endophytic fungus Diaporthe sp. Chem Pharm Bull 54:579-582.
Agusta A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: ITB press. Hal 25-34.
Barik B.P, Tayung K, Jagadev P.N, Dutta S.K. 2010. Phylogenetic Placement of an Endophytic Fungus Fusarium oxysporum Isolated from Acorus calamus Rhizomes with Antimicrobial Activity. EJBS 2(1) : 8-16
Chen Y.R, Wen K.C, Her G.R. 1999. Analysis of coptisine, berberine and palmatine in adulterated Chinese medicine by capillary electrophoresis-electrospray ion trap mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 866 : 273-280.
Keawpradub N, Dej-adisai S and Yuenyongsawad S. 2005. Antioxidant and cytotoxic activities of Thai medicinal plants named Khaminkhruea: Arcangelisia flava, Coscinium blumeanum and Fibraurea tinctoria.
Songklanakarin J. Sci. Technol. 27 : 455-467
Coptidis Rhizoma Reduces Injury in The Rat. Food Chem Toxicol . Vol. 47. Hal : 2097-2102
Kunii. T, Kengo. K, Yoshiyuki. K, Yasushi. N, Yukuo. N and Tadashi. S. 1985.
Indonesian Medical Plants 1. New Furanoditerpenes from Arcangelisia flava L. Merr. Chem. Pharm. Bull. 32 (2) : 479 – 487
Lu H., WX. Zou, JC. Meng, J. Hu, and RX Tan. (2000). New Bioactive
metabolites produced by Colletotrichum sp., an endophytic fungus in Artemisia annua. Plant Sci. 151: 76-73.
Lee J. E. Lobkovsky, NB. Pliam, GA. Strobel, and J. Clardy (1995). Subglutinols
A and B: immunosuppressive compounds from the endophytic fungus Fusarium subglutinans. J.Org.Chem. 60: 7076-7077
Mahesa, Mitra. Fanny. 2009. Biotransformasi Berberin oleh Jamur Endofit dari Tumbuhan Akar Kuning. Universitas Andalas : Padang.
Mandia E.H, Ridsdale C.E, Horsten S.F.A.J, Aguinaldo A.M. 1999. Arcangelisia
flava L.Merr. in Plant Resources of South-East Asia. Backhuys Publisher, Leinden. No (12)1 : 129 -132
Identification
of Its Metabolites in Rat Urine by Liquid
Chromatography RCM (Rapid Commun Mass
Spectrom) Vol. 21 .Hal : 2019-2022.
Petrini, O.T.N, L.T Sieber, O.Viret, 1992. Ecology Metabolite Production and
Substrate Utilization in Endophytic Fungi. Nalt. Toxin, 1 : 189-196
Radji M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan Obat Herbal.Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No.3 : 113 – 126
Rosazza J.P. 1982. Microbial Transformation of Bioactive Compounds. Vol II. Press, Inc Boca Raton, Florida : 179 - 185
Shibuya, H. Kitamura,C. Maheara, S. Nagahata,H. 2003. Transformation of Chincona Alkaloid into 1-N Oxida Derivates by Endophitic Xylaria sp. Isolated from Cinchona pubescens. Chem. Pharm. Bull. 51 (1) : 71-74
Simanjuntak P., T. Parwati, Bustanussalam, TK. Prana, S. Wibowo, H. Shibuya.
2002. Isolasi dan kultivasi mikroba endofit penghasil senyawa alkaloid
kinkona dari Chinchona spp. J. Mikrobiol. Indon. 7(2): 27-30.
Stermitz. F. R, Peter Lorenz, Jeanne N. Tawara, Lauren A. Zenewicz, and Kim Lewis 2000. Synergy in a medicinal plant: Antimicrobial action of berberine potentiated by 5 methoxyhydnocarpin, a multidrug pump inhibitor.PNAS vol. 97 (4) : 1433–1437.
Strobel GA., and B. Daisy.2003, Bioprospecting for Microbial Endophytes and
Their NaturalProducts.Microbiol. and Mol. BiologyRev. 67(4): 491-502. Strobel, GA., E. Ford. J. Woapong, JK. Harper, AM. Arif, DM. Grant, PCW.
Fung, and K. Chan. 2002. Isopestacin, an isobenzopuranone from
Pestalotiopsis microspora, possessing antifungal and antioxidant activities. Pytochemistry 60: 179-183.
Subeki, M. H, Takahashi. K, Yamasaki. M, Yamato. O, Maede. Y, Katakura. K,
Suzuki. M, Trimuningsih, Chairul dan Yoshihara. T. 2005. Antibabesial
Surodjo, Suzana, 2008, Biotransforamsi Asam Mefenamat dengan Kultur Suspensi Sel Solanum mammosum L. ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga.
Tan RX and Zou WX. 2001. Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites.Nat. Prod. Rep , 18 : 448–459
Verpoorte, R, J.Siwon, M. Tieken and A. Baerheim Svendsen. 1982. Studies on Indonesian Medicinal Plants. VII : Alkaloid of Arcangelisia flava. Journal of Natural Product. 45 : 582 – 584.
Wang. F, Hong-Yi , Lan .C, Gang. Z, Ji Zhou, Li-Ying Fu and Wei-Xing .Y. 2003. Effects of Palmatine on Potassium and Calcium currents in Isolated Rat hepatocytes.ISSN .World J Gastroenterol .Vol 9 (2) : 329 – 333.
Zhang,B., G.salituro, D.Szalkowski, Z. Li, Y. Zhang, I. Royo, D. Vilella, M. Dez, F. Pelaes, C. Ruby, RL. Kendall, X. Mao, P. Griffin, J. Calaycay, JR. Zierath,
JV. Heck, RG. Smith, and DE. Moller. (1999). Discovery af small molecule
Lampiran 1. Tabel Komposisi Medium
1.1Tabel 3. Komposisi Medium Potato Dextro Broth (PDB) 24 g/L
No Bahan Jumlah
1 Potatoes infusion 200 g
2 Dextrose 20 g
3 Air Sumur 1 L
1.2Tabel 4. Komposisi Medium Agar 15g / L
No Bahan Jumlah
1 Agar Powder 15 g
2 Air Sumur 1 L
1.3 Tabel 5. Komposisi Medium Potato Dextro Agar (PDA) 39 g/L
No Bahan Jumlah
1 Agar 15 g
2 Dextrose 20 g
3 Potato infusion 4 g
