Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni 2010 - April 2011. Ekstraksi tanaman obat dilakukan di Laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO), pemeliharaan ayam dilakukan di kandang FKH IPB, dan uji tantang virus Avian Influenza H5N1 dilakukan di Laboratorium Biosafety Level 3 (BSL3) milik PT. Vaksindo Satwa Nusantara, Cicadas, Gunung Putri, Bogor. Pemeriksaan patologi dilaksanakan di Laboratorium Patologi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Materi Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan 80 ekor ayam day old chick (DOC) pedaging dengan bobot badan rata-rata 38g, dipelihara dengan pemberian pakan dan minum ad libitum. Pemberian Vaksin Newcastle Disease (ND) pada umur 4 hari dan pemberian vaksin Infectious Bursal Disease (IBD) pada umur 11 hari.
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan adalah timbangan digital, penggiling, tabung steril, gelas ukur, corong pisah, sentrifus, labu penyuling, inkubator, vorteks, penangas air, tabung elenmeyer, blender, kapas, tissue, tabung kromatografi, tabung destruksi, labu penyaring, alat penyaring, pipa kapiler, kandang dan kelengkapannya, alat peniup, alat pengering, pendingin tegak, ekstraktor, spuit, seperangkat alat bedah, kaset histologi, gelas piala, gelas objek, cover glass, pipet, mikropipet, mikrotip, mikrotom rotari, dan mikroskop.
Bahan yang digunakan adalah virus AI subtipe H5N1/Legok/2003, tanaman Sambiloto, Adas dan Sirih Merah, metanol, etanol, aseton dingin, etil asetat, kloroform, aquades, asetat hidrat dan H2SO4, larutan Giemsa, Buffered
Neutral Formaline (BNF) 10%, alkohol dengan konsentrasi bertingkat (70%, 80%, 95%, 96% dan alkohol absolut), xilol, parafin, sitrat buffer, Phosphate- Buffered Saline (PBS), akuades Destilated Water (DW), Tween20 0.1%, H2O2
3%, antibodi primer (monoclonal anti-AI H5N1 antibody), antibodi sekunder (rabbit anti-chicken IgG), diaminobenzidine (DAB), entelan, hematoksilin dan eosin.
Penyiapan Ekstrak Tanaman Terstandar
Jenis tanaman obat yang digunakan sebagai bahan dalam penelitian adalah :
1. Sambiloto (Andrographis paniculata Ness) 2. Adas (Foeniculum vulgare Mill)
3. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz)
Bahan baku tanaman obat untuk ekstraksi dipanen dari koleksi plasma nutfah tanaman obat di lingkup kebun BALITTRO. Ekstraksi dipersiapkan dengan mengikuti prosedur standar pembuatan sediaan berupa simplisia yang meliputi : Sortasi yaitu tanaman yang telah dipanen sebelum dicuci masing- masing bahan disortir dengan tujuan untuk memisahkan bagian tanaman yang baik dengan yang rusak. Pencucian yaitu masing-masing bahan yang telah disortir (yang baik) dicuci dengan air mengalir sampai bersih, lalu ditiriskan. Pengeringan dilakukan dengan menjemur di bawah sinar matahari dan ditutup kain hitam dilanjutkan dengan oven pada suhu 400C hingga kering (kadar air ±10%). Masing-masing bahan digiling dengan menggunakan alat penggiling.
Ekstraksi Tanaman Obat
Ekstraksi dilakukan di BALITTRO. Masing-masing bahan yang sudah digiling dan diayak lalu ditimbang dan dimasukkan ke dalam alat ekstraktor, kemudian ditambah etanol 95% sebanyak 5 kali berat bahan dengan perbandingan 1: 5 (bahan : pelarut) dan diaduk selama 2 jam dengan pengaduk listrik, kemudian didiamkan satu malam. Keesokan harinya disaring dengan kain flanel untuk mendapatkan filtrat. Ampas dari hasil saringan direndam kembali dengan etanol sebanyak 3 kali jumlah bahan dan diaduk selama 30 menit, lalu disaring. Filtrat dari hasil saringan pertama dan kedua disatukan. Selanjutnya filtrat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator (alat penguap) dengan tekanan putaran rendah sehingga didapatkan ekstrak kental, kemudian dilanjutkan penimbangan ekstrak untuk membuat formula yang digunakan dalam penelitian.
Pembuatan Formula
Formula yang digunakan dalam penelitian dibuat dengan cara mencampurkan ekstrak etanol sambiloto setara dengan zat aktif andrografolide, adas setara dengan zat aktif anetol dan sirih merah setara dengan zat aktif piperin. Perbandingan konsentrasi kandungan zat aktif yang setara dalam masing-masing ekstrak tanaman obat disusun berdasarkan metode penelitian yang dilakukan Setiyono et al. (2010). Variasi konsentrasi ekstrak tanaman obat disusun dalam formula sebagai berikut :
1. Sambiloto setara dengan zat aktif Andrografolide : 5%; 7.5%; 10% 2. Adas setara dengan zat aktif Anetol : 5%; 7.5%; 10% 3. Sirih merah setara dengan zat aktif Piperin : 5%; 7.5%; 10% 4. Simplisia Sambiloto, Adas dan Sirih merah
Semua bahan formula ditambah dengan emulsifer tween-80, antioksidan, asam askorbat sebagai penstabil, pengencer digunakan air bersih. Total formula yang diperlukan dalam perlakuan adalah 6 liter. Untuk mengetahui komposisi kimia formula, dilakukan analisis dengan Gas Chromatography Massa Spectrophotometry (GCMS).
Metode Pemeliharaan Hewan Coba
Sebanyak 80 ekor ayam day old chick (DOC) pedaging dengan berat badan rata-rata 38g, dibagi dalam 2 (dua) kelompok (kelompok ayam tidak divaksin AI H5N1 dan kelompok ayam yang divaksin AI H5N1) dan terdiri dari 5 (lima) perlakuan dengan masing-masing kelompok perlakuan berjumlah 8 ekor anak ayam, semua ayam kelompok perlakuan dipelihara dengan pemberian pakan standar dan minum ad libitum.
Uji Perlakuan Ekstrak Etanol Tanaman Obat dalam Formula ke Ayam :
Kelompok perlakuan diberi ekstrak tanaman obat dengan komposisi formula sebagai berikut :
Formula 1 (F1 - 5%) = Formula ekstrak etanol tanaman sambiloto setara dengan zat aktif andrografolide, adas setara dengan zat aktif anetol dan sirih merah setara dengan zat aktif piperin dengan konsentrasi masing-masing 5%
Formula 2 (F2 - 7.5%) = Formula ekstrak etanol tanaman sambiloto setara dengan zat aktif andrografolide, adas setara dengan zat aktif anetol dan sirih merah setara dengan zat aktif piperin dengan konsentrasi masing-masing 7.5%
Formula 3 (F3 - 10%) = Formula ekstrak etanol tanaman sambiloto setara dengan zat aktif andrografolide, adas setara dengan zat aktif anetol dan sirih merah setara dengan zat aktif piperin dengan konsentrasi masing-masing 10%
Formula 4 (F4 - simplisia) = Formula Simplisia tanaman sambiloto, adas dan sirih merah
Pemberian formula ekstrak etanol tanaman sambiloto, adas dan sirih merah terhadap ayam perlakuan selengkapnya disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Metode pemberian formula ekstrak etanol tanaman sambiloto, adas dan sirih merah dengan konsentrasi F1 - 5%, F2 - 7.5%, F3 - 10% dan F4- simplisia terhadap ayam pada kelompok perlakuan
Kelompok Perlakuan Jumlah ayam (ekor) Jenis perlakuan Tanaman Obat (umur 4 s/d 25 hari) Vaksinasi AI (umur 21 hari) Tantang virus AI H5N1 (umur 44 hari) I-F1- 5% 8 + - + I-F2- 7.5% 8 + - + I-F3- 10% 8 + - + I-F4-simplisia 8 + - + I-K 8 - - + II-F1- 5% 8 + + + II-F2- 7.5% 8 + + + II-F3- 10% 8 + + + II-F4-simplisia 8 + + + II-K 8 - + +
Keterangan : F = formula ekstrak dengan konsentrasi, K = kontrol (+) =diberikan, (-) = tidak diberikan
Pemeriksaan Performance Ayam Perlakuan
Penimbangan berat badan ayam perlakuan dilakukan seminggu sekali selama berlangsungnya penelitian. Penimbangan ayam dilakukan secara individu mulai dari minggu pertama sampai dengan minggu ke enam. Tujuan penimbangan ayam adalah untuk mengetahuhi pengaruh pemberian formula konsentrasi ekstrak etanol tanaman sambiloto, adas dan sirih merah dengan berbagai konsentrasi terhadap berat badan ayam perlakuan.
Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan darah ayam pada kelompok perlakuan (I dan II) dilakukan sebanyak tiga kali diantaranya, pada saat ayam berumur 21 hari, ayam berumur 44 hari dan saat ayam berumur 51 hari. Tujuan pengambilan darah adalah untuk dilakukan pemeriksaan diferensial leukosit dan uji titer antibodi AI. Darah diambil sebanyak 1-2 ml melalui vena brachialis, kemudian diletakkan pada suhu ruang selama lebih kurang satu jam atau sampai serum terpisah dari darah. Serum yang diperoleh disimpan dalam tempat penyimpanan dengan suhu 40C.
Pemeriksaan yang dilakukan dari sampel darah meliputi : Pemeriksaan Diferensial Leukosit
Pemeriksaan diferensial leukosit terhadap sampel darah dilakukan dengan cara meletakkan setetes darah pada objek gelas dan mengulas tipis, dilakukan pewarnaan dengan Giemsa dan diamati di bawah mikroskop untuk mengetahui jumlah sel leukosit yang terdapat dalam darah kemudian dilakukan perhitungan terhadap 100 sel leukosit yang meliputi sel limfosit, monosit, heterofil, eosinofil dan basofil dengan menggunakan pembesaran 1.000 X.
Uji Hemaglutinin Inhibisi (HI)
Uji HI dilakukan dengan mengambil sebanyak 0.025 ml Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.2 dimasukkan ke dalam lubang-lubang cawan mikro yang terdiri dari 96 lubang. Kemudian ditambahkan 0.025 ml serum sampel dan serum positif pada lubang pertama lalu ditambahkan serial kelipatan 2 dari lubang pertama hingga lubang ke-11 dan lubang ke-12 dipergunakan sebagai kontrol sel darah merah. Selanjutnya 0.025 ml antigen virus AI H5N1 sebesar 4 Haemaglutination Unit (HAU) ditambahkan ke dalam setiap lubang kecuali pada lubang ke-12 yang berisi sel darah merah ditambahkan dengan 0.025 PBS dan selanjutnya dicampur dengan alat pencampur selama 30 detik sebelum diinkubasi pada suhu 200C selama 30 menit. Selanjutnya 0.025 ml sel darah merah 1% (SDM) ditambahkan ke dalam setiap lubang, kemudian dicampur dengan alat pencampur selama 30 detik dan diinkubasi pada suhu 200C selama 40 menit. Interpretasi hasil titer HI ditunjukkan pada pengenceran serum tertinggi yang masih memberikan inhibisi (penghambatan) aglutinasi pada antigen 4 HAU. Inhibisi ditetapkan dengan melakukan pengamatan sel darah merah pada lubang-
lubang cawan mikro, apabila cawan mikro dimiringkan terlihat sel darah merah mengendap yang serupa dengan sel darah merah kontrol.
Uji Tantang dengan Virus AI H5N1
Ayam yang telah diberi formula ekstrak etanol tanaman obat selama 21 hari dan diadaptasikan selama 19 hari kemudian dibawa ke Laboratorium Biosafety Level 3 (BSL3) milik PT. Vaksindo Satwa Nusantara, Cicadas, Gunung Putri, Bogor untuk dilakukan uji tantang virus AI H5N1 secara intranasal dengan dosis 0.1 ml (106EID50) per ekor. Pengamatan daya tahan hidup ayam dilakukan
selama 6 hari setelah semua ayam ditantang dengan virus AI H5N1. Ayam yang mati pada hari pengamatan setelah ditantang dengan virus AI, atau ditemukan semua ayam masih hidup sampai hari ke-6 setelah ditantang dengan virus AI, maka ayam tersebut dimatikan dan diambil organ limfoid (bursa Fabricius, limpa dan timus) dengan membedah (nekropsi) ayam yang mati tersebut untuk dievaluasi dengan pembuatan preparat histopatologi menggunakan perwarnaan Hematoksilin Eosin (HE) dan Imunohistokimia (IHK).
Pembuatan Preparat Histopatologi
Organ terpilih dimasukkan kedalam BNF 10% untuk difiksasi, kemudian dilakukan dehidrasi menggunakan mesin tissue processor dengan alkohol bertingkat, selanjutnya direndam dalam parafin cair sebelum diblok. Selanjutnya proses embedding dalam parafin dan didinginkan pada suhu kamar sehingga menjadi blok parafin kemudian dipotong dengan mikrotom setebal 3-4 µm lalu ditempelkan pada objek gelas (preparat) yang sebelumnya dilapisi dengan gelatin dan kromium potasium sulfat (CrK(SO4)). Selanjutnya, preparat dideparafinisasi
dan rehidrasi sebelum dilakukan pewarnaan secara imunohistokimia dan hematoksilin eosin.
Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE)
Pewarnaan HE dilakukan untuk melihat perubahan patologis organ limfoid (organ pertahanan) ayam pedaging akibat virus AI. Proses awal pewarnaan jaringan melakukan deparafinisasi yaitu jaringan direndam dalam xylol I,II,III, lalu dilanjutkan ke dalam absolut sampai ke alkohol 70% masing-masing selama 3 menit. Kemudian dicuci dengan air kran atau destillated water (DW) selama 5
menit. Kemudian direndam dalam hematoksilin selama 1 menit, lalu dicuci dengan air kran atau DW selama 5 menit. Selanjutnya direndam dalam eosin selama 2 menit, lalu dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 70% sampai alkohol absolut dan dilanjutkan dengan clearing dengan xylol I, II, III. Kemudian mounting dengan entelen dan ditutup dengan cover glass dan dilakukan pengamatan dengan mikroskop. Hasil dari pewarnaan HE akan terlihat inti sel berwarna kebiruan dan sitoplasma terlihat berwarna merah muda.
Pewarnaan Imunohistokimia (IHK)
Metode pewarnaan deteksi antigen AI ini mengacu pada metode Temasek Laboratorium Singapura dengan menggunakan citrat buffer untuk unmasking antigen. Blocking aktifitas endogenus menggunakan hidrogen peroksida (H2O2)
3% selama 20 menit, kemudian dicuci dengan PBS tween selanjutnya direndam dengan skim milk 0.1% dalam PBS selama 30 menit untuk meminimalisir reaksi non-spesifik dan dicuci kembali dengan PBS tween. Antibodi primer yang digunakan adalah antibodi monoklonal H5N1 (Astawa et al. 2001) dan diinkubasi selama 24 jam di suhu 40C. Setelah 24 jam preparat dibilas dengan PBS tween kemudian ditambahkan antibodi sekunder (chicken anti IgG) yang akan berikatan dengan antibodi primer, dan selanjutnya diinkubasi selama 1 jam. Sebagai kromogen digunakan diamino benzidine (DAB), dilakukan setelah antibodi sekunder, dibilas dengan DW. Counterstain menggunakan Lillie Mayer Hematoksilin untuk mendapatkan warna kebiruan sebagai latar belakang jaringan dan antigen AI yang telah terwarnai dengan kromogen akan berwarna coklat kemerahan. Pemeriksaan dinyatakan positif apabila ditemukannya antigen AI yang berwarna kecoklatan dan negatif apabila tidak ditemukan antigen AI H5N1.
Dalam penelitian ini pemeriksaan antigen AI dilakukan dengan obyektif 20X, berdasarkan jumlah antigen per satu lapang pandang per organ, dengan memberikan skor sebagai berikut : + (untuk 1-20 antigen/satu lapang pandang), ++ (untuk 21-40 antigen/satu lapang pandang) dan +++ (untuk lebih dari 41 antigen/satu lapang pandang) sedangkan – (untuk yang tidak ditemukan antigen per satu lapang pandang/negatif).
Analisa Data
Data hasil pemeriksaan diferensial leukosit, dan performance dianalisa secara statistik menggunakan analisa sidik ragam (ANOVA) dengan menggunakan software SPSS 17. Jika terdapat perbedaan pada masing-masing kelompok perlakuan maka dilakukan uji Duncan. Hasil pemeriksaan HI, HE dan IHK dianalisa secara deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN