METODE PENELITIAN
3.1. Desain
Penelitian ini merupakan uji diagnostik untuk mengetahui sensitivitas, spesifisitas, nilai duga positif, dan nilai duga negatif dari hematological scoring system (HSS) sebagai alat uji diagnostik dini sepsis pada neonatus.
3.2. Tempat dan waktu
Penelitian ini dilakukan di unit rawat inap neonatologi Rumah Sakit Umum Haji Adam Malik selama 4 bulan mulai Maret sampai Juni 2013.
3.3. Populasi dan sampel
Populasi target adalah neonatus yang diduga mengalami sepsis. Populasi terjangkau adalah populasi target di unit neonatologi Rumah Sakit Umum Haji Adam Malik selama bulan Maret sampai Juni 2013. Sampel adalah populasi terjangkau yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
3.4. Perkiraan besar sampel
Besar sampel dihitung dengan menggunakan rumus besar sampel untuk uji diagnostik. Mengacu pada penelitian yang dilakukan Narasimha dan Kumar (tahun 2011) dengan sensitivitas yang diharapkan sebesar 91.6% dengan toleransi sebesar
10% maka sampel yang diperlukan adalah seperti perhitungan rumus sebagai berikut , yaitu:45 N = Z2 PQ d2 P = Sensitivitas = 0. 916 Q = 1 – P = 1 – 0.916 = 0.084
Z = nilai baku normal = 1.96 ( dengan interval kepercayaan 95% ) d = 0.916 ( 10% dari 91,6% )
Dengan menggunakan rumus di atas didapat jumlah sampel sebanyak 36 orang.
3.5. Kriteria inklusi dan eksklusi
3.5.1. Kriteria Inklusi
1. Bayi usia 0 sampai 28 hari.
2. Neonatus didiagnosis dengan sangkaan sepsis berdasarkan manifestasi klinis dan faktor risiko ibu atau faktor risiko bayi.
3. Sampel darah diambil sebelum mendapat antibiotik atau mendapat antibiotik kurang dari 48 jam.
3.5.2. Kriteria Eksklusi
1. Bayi dengan anemia sebelum 24 jam. 2. Bayi dengan kelainan kongenital.
3.6. Persetujuan/informed consent
Semua sampel penelitian telah disetujui orang tua masing-masing setelah dilakukan penjelasan terlebih dahulu untuk pemeriksaan darah.
3.7. Etika penellitian
Penelitian ini disetujui oleh Komite Etik Kesehatan dari Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
3.8. Cara Kerja dan Alur Penelitian 3.8.1. Sampel
1. Sampel dikumpulkan secara consecutive sampling.
2. Neonatus (usia 0 sampai 28 hari) yang didiagnosa dengan sangkaan sepsis oleh dokter spesialis anak.
3.8.2. Pengambilan sampel darah
1. Pengambilan sampel darah untuk pemeriksaan darah lengkap, kultur darah, dan hapusan darah tepi.
2. Pengambilan darah untuk pemeriksaan darah lengkap dan kultur darahmelalui vena mediana cubiti atau vena femoralis dengan terlebih dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan alkohol 70% dan dibiarkan kering.
3. Pengambilan darah sebanyak 3cc dilakukan dengan menggunakan dispossible syringe 3cc untuk pemeriksaan darah lengkap.
Pengambilan darah untuk kultur darah sebanyak 1cc dengan dispossible syringe 1cc kemudian dimasukkan kedalam tabung.
4. Pengambilan darah untuk pemeriksaan darah lengkap dilakukan pada saat bayi datang.
5. Pengambilan darah untuk kultur dilakukan pada pagi hari (pukul 10.00- 12.00 WIB) sehingga jika bayi datang setelah pukul 12.00 WIB, maka darah akan diambil keesokan harinya.
6. Pengambilan darah untuk sediaan hapusan darah tepi dilakukan satu kali pengambilan pada waktu yang sama dengan petugas laboratorium Patologi Klinik atau Mikrobiologi atau jika pada waktu yang berbeda dilakukan dengan menusuk tumit bayi, kemudian dibuat hapusan darah di object glass.
7. Pemeriksaan darah lengkap dilakukan oleh petugas laboratorium Patologi Klinik RS Haji Adam Malik Medan.
8. Pemeriksaan kultur darah dilakukan oleh petugas laboratorium Mikrobiologi RS Haji Adam Malik Medan.
9. Pengambilan hapusan darah tepi dilakukan oleh peneliti.
Cara Kerja pemeriksaan kultur darah (menurut Standart Operating Procedure. Instalasi Mikrobiologi RSUP. H.Adam malik, April 2009):
b. Darah dimasukkan ke dalam Bouillon dengan perbandingan 1 : 10, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
c. Amati pertumbuhan kuman.
d. Jika tampak ada pertumbuhan kuman, lalu diinokulasikan pada agar darah Mc Conkey.
e. Khusus inokulasi pada agar darah, penggoresan pada media dilakukan secara menyilang di bagian tengah media agar darah, kemudian dibuat goresan sepanjang goresan pertama, dengan arah tegak lurus terhadap goresan pertama. Kemudian buat goresan tegak lurus terhadap goresan terakhir sampai media penanaman penuh. f. Inkubasi agar darah dan agar Mc Conkey pada suhu 370C selama 24
jam.
g. Hitung koloni yang tumbuh pada agar darah.
h. Koloni yang tumbuh pada agar darah (setelah hitung koloni) dan agar Mc Conkey dilakukan pewarnaan Gram.
i. Bakteri Gram (+) kokus dari koloni yang tumbuh pada agar darah dilanjutkan dengan uji katalase dan uji identifikasi dengan alat VITEK 2.
j. Bakteri Gram (-) batang dari koloni yang tumbuh pada agar Mc Conkey dilanjutkan dengan uji identifikasi bakteri dengan alat VITEK 2.
k. Hasil dapat diperoleh selama lebih kurang 1 minggu dari laboratorium Mikrobiologi RS Haji Adam malik Medan.
a. Pengambilan darah perifer yang dilakukan bersamaan dengan petugas laboratorium Patologi Klinik ataupun Mikrobilogi RSUP HAM dengan meneteskan 2-3 tetes darah dari dispossible syringe pada tiga object glass, jika pada waktu yang berbeda, pengambilan melalui tumit bayi, dengan tindakan aseptik terlebih dahulu dengan alkohol 70% dan dibiarkan kering. Tumit bayi ditusuk dengan hemolet kecil kemudian darah diteteskan pada tiga object glass, kemudian dihapus pada object glass sehingga menjadi tipis lalu dikeringkan, kemudian difiksasi dengan metanol selama 5-10 menit, lalu dilakukan pewarnaan dengan giemsa.
b. Sediaan hapusan darah tepi yang sudah dicat dengan giemsa kemudian dibaca di bawah mikroskop binokuler dengan pembesaran 100 kali.
c. Dihitung total PMN, hitung total PMN imatur, rasio PMN imatur dan PMN total (rasio I:T), rasio PMN imatur dan PMN matur (rasio I:M), perubahan degeneratif PMN pada 3 slide kemudian dihitung rata- ratanya.
d. Pengambilan sediaan hapus darah dan pembacaan dilakukan oleh peneliti dan analis.
a. Hitung jumlah leukosit melalui hasil pemeriksaan darah lengkap. Jika Hitung total leukosit ≤ 5000/µl atau ≥ 25.000 saat lahir atau ≥ 30.000 pada 12-24 jam atau ≥ 21.000 pada hari kedua diruangan maka skor = 1.
b. Hitung total PMN jika tidak ada PMN matur yang terlihat maka skor = 2, jika meningkat/menurun maka skor = 1.
c. Hitung PMN imatur jika meningkat maka skor = 1. d. Rasio PMN I:T jika meningkat maka skor = 1. e. Rasio PMN I:M ≥ 0.3 maka skor = 1.
f. Ditemukannya perubahan degeneratif PMN berupa granular toksik atau vakuolisasi sitoplasma maka skor = 1.
g. Hitung trombosit ≤ 150.000/ µl maka skor = 1.
h. Semua skoring dijumlahkan sehingga didapatkan nilai skor mulai dari 1 sampai 8.
i. Penilaian skoring dilakukan satu kali pada setiap bayi dari hasil pemeriksaan darah lengkap dan hapusan darah tepi saat bayi datang. j. Skoring HSS dilakukan oleh peneliti.
3.9. Identifikasi Variabel
Variabel bebas skala
HSS ordinal
Variabel tergantung skala
Kultur darah nominal
3.10. Definisi Operasional
1. Neonatus adalah bayi berusia 0 sampai 28 hari.
Pemeriksaan kultur darah,dan pemeriksaan leukosit, neutrofil imatur, neutrofil matur, granular toksik/vakuolisasi sitoplasma, trombosit
Skoring HSS bernilai dari 1 sampai 8
Kultur darah Positif : bila dijumpai pertumbuhan kuman dalam darah Sampel
(neonatus dengan sangkaan sepsis)
Penilaian hasil skor HSS dan hasil kultur darah
2. Sangkaan sepsis pada neonatus apabila memenuhi 3 atau lebih manifestasi klinis dengan faktor risiko ibu atau faktor risiko bayi, ataupun tanpa manifestasi klinis namun dijumpai faktor risiko ibu atau faktor risiko bayi. Diagnosa sangkaan sepsis ditegakkan oleh dokter spesialis anak konsultan neonatologi. Manifestasi klinis yang dapat ditemui sebagai berikut ini:
a. Gangguan minum, dimana dijumpai neonatus tidak mau minum atau menyusu.
b. Ketidakstabilan suhu, dimana hipotermia didefinisikan dengan pengukuran suhu pada axilla < 36oC atau hipertermia jika suhu axilla > 37.9oC.
c. Ikterus atau hiperbilirubinemia adalah dijumpai kuning pada neonatus dan dijumpai nilai bilrubin total lebih dari 1mg/dL dan bilirubin direct antara 0-0.2.
d. Gangguan gastrointestinal, ditemukan gejala muntah, perut distensi, buang air besar berdarah, peningkatan residu diet, intoleransi minum.
e. Gangguan kardiovaskular, dijumpai takikardia persisten (denyut jantung > 180x/menit), bradikardia (denyut jantung < 80 x/menit), perfusi jaringan yang buruk (capillary refill time ≥ 3 detik), hipotensi (tekanan darah sistolik < 50 mmHg untuk bayi
usia 1 hari dan tekanan darah sistolik < 65 mmHg untuk bayi 1 bulan).
f. Gangguan pernafasan, dijumpai takipnu (frekuensi nafas lebih dari 70x/menit), dijumpai retraksi pernafasan dan peningkatan kebutuhan oksigen dan kemungkinan apnu.
g. Hiperglikemia (kadar gula darah > 250 mg/dL) atau hipoglikemia (kadar gula darah < 45 mg/dL).
h. Gangguan neurologis, dijumpai letargis, penurunan kesadaran, kejang, merintih.
3. Faktor risiko sepsis dari ibu adalah dijumpai ketuban pecah dini dan ketuban pecah lebih dari 18 jam, infeksi saat kehamilan (Infeksi bakteri, infeksi parasit, infeksi virus, korioamnionitis), demam (suhu
axilla lebih dari 38°C) pada masa peripartum, infeksi saluran kemih,
cairan ketuban hijau keruh dan berbau, kehamilan multipel, dan persalinan kurang bulan.
4. Faktor risiko sepsis pada bayi adalah prematuritas dan berat lahir rendah, asfiksia neonatorum, resusitasi pada saat kelahiran, mendapatkan prosedur invasif seperti intubasi endotrakeal, pemakaian ventilator, kateter, infus, pembedahan, dan akses vena sentral.
5. Kultur darah merupakan baku emas dalam menegakkan diagnosa sepsis. Kultur darah bertujuan untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan bakteri pada darah. Pemeriksaan kultur darah
dilakukan dengan automatic BACTEC method dan uji identifikasi kuman menggunakan alat VITEK 2 (standar JCI 2012).
6. Sepsis pada neonatus adalah bila dijumpai manifestasi klinis dan kultur darah positif (dijumpai pertumbuhan bakteri dalam darah).
7. Pemeriksaan darah lengkap adalah pemeriksaan yang dilakukan untuk menilai parameter hematologi sepsis berupa leukosit dan trombosit. 8. Pemeriksaan hapusan darah tepi adalah pemeriksaan yang dilakukan
untuk menilai parameter hematologi sepsis berupa total PMN, PMN imatur, PMN matur, dan perubahan degeneratif PMN.
9. HSS adalah suatu alat uji diagnostik yang bertujuan untuk diagnosis sepsis secara dini dengan melihat beberapa parameter hematologi yaitu jumlah leukosit, trombosit, total PMN (neutrofil imatur dan neutrofil segmen), hitung total PMN imatur (neutrofil batang, promielosit, mielosit, metamielosit), rasio PMN imatur ke total (rasio PMN I:T), rasio PMN imatur ke matur (rasio PMN I:M), dan perubahan degeneratif PMN yang dapat dinilai pada sediaan hapusan darah tepi dalam 100 lapangan pandang.
3.11. Pengolahan dan analisis data
Perbedaan kemampuan diagnostik sediaan hapus darah tepi dibandingkan dengan kultur darah dianalisis dengan tabel 2x2 dengan menghitung sensitivitas, spesifisitas dan nilai duga positif dan nilai duga negatif dengan interval
kepercayaan 95% dan P< 0.05. Untuk menentukan titik potong terbaik hasil uji diagnostik dibuat kurva ROC. Hubungan dua variabel yaitu HSS dan kultur darah dianalisa dengan Chi square (X2) atau uji Fisher exact. Data yang terkumpul akan diolah, dianalisis, dan disajikan dengan menggunakan program komputer.