3.1 Desain penelitian
Desain penelitian ini adalah suatu studi analitik potong lintang. Penelitian diawali dengan mengumpulkan data rekam medik dari Departemen Ilmu Penyakit Dalam Divisi Hematologi Onkologi Medik FKUI RSUPN Cipto Mangunkusumo. Kemudian dicari slaid Haematoxylin Eosin yang ada di arsip Departemen Patologi Anatomik, dilakukan penilaian ulang mengenai gambaran histopatologik. Selanjutnya dicari blok parafin dipilih secara consecutive dan memenuhi kriteria inklusi, dilakukan potong dalam slaid polos untuk pemulasan imunohistokimia CD20 dan Top2A.
3.2 Tempat dan waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Anatomik dan Departemen Ilmu Penyakit Dalam Divisi Hematologi Onkologi Medik FKUI RSUPN/CM dan berlangsung selama 1 tahun dari bulan Oktober 2011 sampai bulan September 2012.
3.3 Populasi dan sampel penelitian
Populasi penelitian adalah kasus-kasus yang didiagnosis sebagai DLBCL secara histopatologik yang mendapat terapi CHOP maupun RCHOP. Populasi terjangkau adalah kasus-kasus dengan diagnosis PA DLBCL dengan terapi CHOP/RCHOP di RSCM tahun 2009 sampai dengan tahun 2012. Sampel adalah blok parafin dari kasus-kasus tersebut di atas dipilih secara consecutive dan memenuhi kriteria inklusi.
Penghitungan sampel menggunakan rumus besar sampel analitik numerik tidak berpasangan
N1= N2=
N1 dan N2 : Besar sampel masing-masing kelompok
S : Standar deviasi ekspresi Top2A pada DLBCL, dari penelitian sebelumnya didapatkan angka 19
Xa-Xo : perbedaan ekspresi Top2A pada DLBCL yang masih dapat diterima (11)
Zα : 1,645
Zβ : 0,842
N1= N2=
N1= N2= 19
Total sampel yang diperlukan minimal = 2 x 19 = 38 kasus Untuk penelitian ini dipakai sampel sebanyak 38 kasus
3.4 Kriteria Inklusi dan eksklusi Kriteria Inklusi :
- Jaringan biopsi kasus di RSUPN/CM tahun 2009-2012 yang didiagnosis PA sebagai DLBCL dan terbukti sebagai sel B dengan pulasan CD20/CD79a (+).
- Data klinik dan respon terapi lengkap. - Blok parafin masih tersedia dan baik.
- Penderita telah mendapat kemoterapi minimal 4 siklus.
Kriteria eksklusi:
- Blok parafin yang telah habis massa tumornya. - Slide rontok saat pembuatan pulasan.
(Zα + Zβ)S (Xa-Xo)
2
(1,645 x 0,842)19
3.5 Variabel Penelitian
Variabel bebas adalah ekspresi Top2A, sedangkan variabel tergantung adalah respon terapi.
3.6 Batasan operasional
3.6.1 DLBCL adalah neoplasma yang terdiri atas proliferasi difus sel limfosit B berukuran hampir sama atau sama dengan inti makrofag normal atau dua kali lebih besar dari limfosit normal, dibuktikan dengan pulasan imunohistokimia CD20 (+) atau CD79a.
3.6.2 Kemoterapi CHOP yang diberikan yaitu: 750 mg/m2 siklofosfamid iv/hari, 1; 50 mg/m2 doksorubisin iv/hari, 1; 1.4 mg/m2 vinkristin iv, dosis maksimal 2 mg; dan 100 mg/m2 prednison per oral selama lima hari. Kemoterapi diulang setiap 4 minggu dengan total 6 sampai 8 siklus.
Kemoterapi RCHOP yang diberikan yaitu: 375 mg/m2 rituximab iv/hari, 750 mg/m2 siklofosfamid iv/hari, 1; 50 mg/m2 doksorubisin iv/hari, 1; 1.4 mg/m2 vinkristin iv, dosis maksimal 2 mg; dan 100 mg/m2 prednison per oral selama lima hari. Kemoterapi diulang setiap 4 minggu dengan total 6 sampai 8 siklus. 3.6.3 Ekspresi Top2A dinyatakan dengan H-score = (i+1) Pi
Pi : persentase sel yang terwarnai positif (0-100%), i = skor 0,1,2,3.
Skor 0 : negatif, skor 1 : intensitas lemah, skor 2 : intensitas sedang, skor 3 : intensitas kuat.
Hasil perhitungan akan menunjukkan kisaran angka 100-400.
3.6.4 Kriteria respon dilihat dari data rekam medis. Respon kemoterapi ditentukan secara klinis berdasarkan kriteria WHO complete response (CR),
3.7 Alur Penelitian
Menilai ulang slide mikroskopik sediaan HE dan IHK kasus DLBCL
Potong dalam/ unstained blok parafin untuk dipulas Top2A
Menilai positifitas Top2A
Kasus DLBCL dengan data respon terapi lengkap dari data rekam medis penderita
Penilaian hubungan antara ekspresi Top2A dengan respon terapi Slide IHK CD20 tidak ditemukan CD20 (+) Menilai positifitas CD20 CD20 (-) Potong dalam/ unstained blok parafin untuk dipulas CD20 dikeluarkan CD79a (+) CD79a (-)
3.8 Metode Pewarnaan Imunohistokimia
3.8.1 Pulasan imunohistokimia dengan CD20
Pulasan CD20 dilakukan untuk mengkonfirmasi asal sel B. Apabila tidak ditemukan slaid imunohistokimia dengan CD20 positif akan dilakukan potongan blok parafin ulang untuk menilai CD20, dan jika negatif akan dilanjutkan dengan CD79a, jika positif akan dijadikan sampel penelitian dan jika masih negatif akan dikeluarkan dari sampel penelitian.
Potongan blok parafin untuk CD20 dilakukan setebal 4 mikrometer dengan tehnik imunoperoksida avidin-biotin. Antibodi primer yang digunakan:
monoclonal mouse anti human CD20 (Biocare Medical).
Cara:
3.8.1.1 Deparafinisasi dan rehidrasi.
3.8.1.2 Bloking peroksida endogen dengan 0,3% hidrogen peroksida dalam methanol selama 30 menit.
3.8.1.3 Pemanasan/ antigen retrieval menggunakan microwave 750 watt selama 10 menit.
3.8.1.4 Bloking protein non spesifik dengan Background Sniper (Starr Trek Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 15 menit. 3.8.1.5 Inkubasi dengan antibodi primer monoclonal mouse anti human CD20
(Biocare Medical), pengenceran 1: 100 selama 60 menit.
3.8.1.6 Inkubasi dengan antibodi sekunder Biotinylated secondary antibody (Trekkie Universal link / Starr Trek Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 15 menit.
3.8.1.7 Inkubasi dengan Horseradish Peroxidase (HRP) labelled- streptavidin (TrekAvidin-HRP / Starr Trek Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 10 menit
3.8.1.8 Color development dengan larutan Betazoid DAB (Diaminobenzidine) Chromogen 1 tetes dalam Betazoid DAB buffer 1 ml (Starr Trek
Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 3 menit. 3.8.1.9 Counterstain dengan haematoxylin Lilie Mayer selama 2-3 menit.
3.8.1.10 Dehidrasi bertingkat (Alkohol 70%, 80% dan 90% dan ethanol) dan
3.8.1.11 Mounting dengan entelan.
Setiap pulasan disertakan kontrol negatif dari setiap kasus dan setiap kali membuat pulasan (10-15 kasus) disertai kontrol positif dari timus dengan CD20 positif sebagai kontrol tehnik pulasan dan standar penilaian.
3.8.2 Pulasan imunohistokimia dengan Top2A
Dilakukan pada potongan blok parafin setebal 4 mikrometer dengan tehnik imunoperoksida avidin-biotin. Antibodi primer yang digunakan: monoclonal
mouse anti human Topoisomerase II α (DAKO).
Cara:
3.8.2.1 Deparafinisasi dan rehidrasi.
3.8.2.2 Bloking peroksida endogen dengan 0,3% hidrogen peroksida dalam methanol selama 30 menit.
3.8.2.3 Pemanasan/ antigen retrieval menggunakan microwave 750 watt selama 10 menit.
3.8.2.4 Bloking protein non spesifik dengan Background Sniper (Starr Trek Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 15 menit. 3.8.2.5 Inkubasi dengan antibodi primer monoclonal mouse anti human
Topoisomerase II α (DAKO), pengenceran 1: 1000 selama 60 menit.
3.8.2.6 Inkubasi dengan antibodi sekunder Biotinylated secondary antibody (Trekkie Universal link / Starr Trek Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 15 menit.
3.8.2.7 Inkubasi dengan Horseradish Peroxidase (HRP) labelled- streptavidin (TrekAvidin-HRP / Starr Trek Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 10 menit.
3.8.2.8 Color development dengan larutan Betazoid DAB (Diaminobenzidine) Chromogen 1 tetes dalam Betazoid DAB buffer 1 ml (Starr Trek
Universal HRP Detection System-Biocare Medical) selama 3 menit. 3.8.2.9 Counterstain dengan haematoxylin Lilie Mayer selama 2 menit.
3.8.2.10 Dehidrasi bertingkat (Alkohol 70%, 80% dan 90% dan ethanol) dan
clearing dengan xylol bertingkat (I, II dan III).
Setiap pulasan disertakan kontrol negatif dari setiap kasus dan setiap kali membuat pulasan (10-15 kasus) disertai kontrol positif dari karsinoma payudara dengan Top2A positif 30% sebagai kontrol tehnik pulasan dan standar penilaian.
3.9 Penilaian ekspresi CD20
Positifitas pulasan CD20 terlihat sebagai warna coklat pada membran sitoplasma. Penilaian dilakukan dengan menghitung jumlah sel tumor yang terwarnai coklat pada membrannya dibagi dengan seluruh jumlah sel tumor dikalikan dengan 100%, dilakukan pada lima lapangan pandang dengan menggunakan mikroskop Axio Carl Zeiss, kemudian dihitung nilai rata-rata dari lima lapangan pandang tersebut.
3.10 Penilaian ekspresi Top2A
Positifitas pulasan Top2A terlihat sebagai warna coklat pada inti sel. Sistem skoring dilakukan secara kontinyu pada 5 lapangan pandang area non nekrotik dan dilakukan pengambilan gambar dengan mikroskop Axio Carl Zeiss. Pada masing-masing gambar dihitung jumlah inti sel yang berwarna coklat dengan menggunakan cell counter secara manual dengan menggunakan program
image-J. Intensitas pulasan juga dihitung dengan penilaian yaitu: Skor 0: negatif,
skor 1: intensitas lemah, skor 2: intensitas sedang, skor 3: intensitas kuat. Kemudian dilakukan penilaian secara semikuantitatif dengan mengalikan skor persentase sel dengan angka intensitas pulasan ditambah satu, untuk mendapatkan histoscore (H-score) dengan rumus yaitu :34
H-score = (i+1) Pi
Pi : persentase sel yang terwarnai positif (0-100%), i = skor 0,1,2,3.
Hasil perhitungan akan menunjukkan skor minimal 100 (negatif) dan skor maksimal 400. Penghitungan ekspresi Top2A ini dilakukan oleh 3 orang pengamat secara independen. Uji kesesuaian antar pengamat dilakukan dengan uji t tidak berpasangan.
3.11 Analisis data
Semua data dimasukkan ke dalam tabel induk. Data respon terapi dikategorikan juga menjadi 2 kelompok yaitu kelompok respon dan tidak respon. Data pulasan imunohistokimia Top2A dibuat dalam bentuk H-score (100-400) yang dideskripsikan dengan nilai median, nilai minimum dan maksimum, kemudian untuk membuat kategori dua kelompok yaitu Top2A rendah dan tinggi dibuat titik potong dengan menggunakan nilai median, selanjutnya dilakukan uji statistik Chi-square jika memenuhi persyaratan dan uji Fisher’s exact jika tidak memenuhi syarat. Analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat SPSS 20.
BAB IV