Metode yang diterapkan adalah metode deskriptif meliputi pengumpulan bahan tanaman, identifikasi tanaman, pengolahan tanaman, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis kromatografi kertas (KKt), uji kemurnian isolat, dan identifikasi senyawa hasil isolasi (isolat) secara spektrofotometri (UV) dengan penambahan pereaksi geser (shift reagen).
Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, blender (National), neraca kasar (Ohaus), neraca listrik (Sartorius), alat perkolasi, eksikator, penangas air (Yenaco), freeze dryer, penguap vakum putar (Buchi 461), chamber, seperangkat alat penetapan kadar air, mikroskop (Olympus), lampu spiritus, kaca objek, kaca penutup dan spektrofotometer (UV) (Shimadzu UV-1240).
Bahan-bahan yang digunakan
Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah herba patikan kebo (Euphorbiae hirtae herba). Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain berkualitas pro analisis yaitu n-heksan, etil asetat, etanol, metanol, isopropanol, benzen, toluen, asam asetat glasial, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, amil alkohol, kloroform, n-butanol, asam nitrat pekat, natrium hidroksida timbal (II) asetat, besi (III) klorida, iodium, raksa (II) klorida, aluminium (III) klorida, kalium iodida, asam asetat anhidrat, asam borat, serbuk magnesium, alpa naftol, kloralhidrat, floroglusinol, air suling, kertas Whatman No.1 dan No. 3.
Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan Pengambilan Bahan Tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah herba patikan kebo (Euphorbiae hirtae herba) yang telah lengkap dengan bunga, buah dan biji, yang diperoleh dari kampung susuk, Kecamatan Medan Selayang, Medan, Sumatera Utara.
Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan telah dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI, Bogor. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 40. Gambar tumbuhan dan simplisia dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 41.
Pengolahan Bahan Tumbuhan
Herba patikan kebo yang telah dikumpulkan, disortasi basah yaitu memisahkan tumbuhan lain yang terikut dan kotoran-kotoran, kemudian dicuci untuk menghilangkan tanah dan pengotoran lainnya dilakukan dengan air yang bersih, ditiriskan lalu disebarkan diatas koran polos dan kemudian ditimbang, lalu dilakukan mikroskopik terhadap bahan tumbuhan yang segar, kemudian dipotong-potong dan dipisahkan antara daun dan batang lalu dikeringkan dalam lemari pengering pada temperatur ± 40°C hingga kering atau sampai mudah dipatahkan lalu ditimbang, diperoleh simplisia kering, dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 27. Simplisia kering diserbuk menggunakan blender dan ditimbang sebagai berat serbuk simplisia. Selanjutnya serbuk disimpan dalam kantung plastik dan dimasukkan kedalam lemari pengering untuk mencegah pengaruh lembab dan pengotoran lainnya. Pengolahan bahan tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 3 halaman 42.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi. 3.4.1 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml (Depkes RI, 1979).
Pereaksi Asam Klorida 6 N
Sebanyak 50 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 150 ml(Markham, 1988).
Pereaksi Aluminium Klorida 5% b/v
Sebanyak 5,0 g aluminium klorida ditimbang kemudian dilarutkan dalam etanol hingga 100 ml (Markham, 1988).
Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8,0 g bismut (III) nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat dan dilarutkan 27,2 g, kalium iodida dalam 50 ml air suling. Campur kedua larutan dan diamkan sampai memisah sempurna. Diambil larutan jernih dan diencerkan dalam air secukupnya hingga 100 ml (Depkes RI, 1995).
Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4,0 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g iodium sedikit demi sedikit dan dicukupkan dengan air suling hingga volume 100 ml (Depkes RI,1979).
Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,36 g raksa (II) klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain, 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml (Depkes RI, 1995).
Pereaksi Molish
Sebanyak 3,0 g α- naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh 100 ml larutan (Depkes RI, 1995).
Pereaksi Timbal (II) Asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g Timbal (II) Asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml (Depkes RI, 1995).
Pereaksi Kloralhidrat jenuh
Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan didalam 20 ml air suling (Depkes RI, 1995).
3.4.10 Pereaksi Asam Klorida 2N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml (Depkes RI, 1979).
3.4.11 Pereaksi Floroglusinol HCl
1,0 g floroglusinol ditambah beberapa tetes HCl pekat sampai memerahkan lignin (Depkes RI, 1995).
3.4.12 Pereaksi Besi (III) klorida 1%
Sebanyak 1,0 g besi (III) klorida dilarutkan dalam air suling hinnga 100 ml (Depkes RI, 1995).
Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut asam, penetapan kadar sari larut dalam air, dan penetapan kadar sari larut dalam etanol (Depkes RI, 1995; WHO, 1992).
3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, bau dan warna dari simplisia herba patikan kebo (Euphorbiae hirtae herba).
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Sebelum dilakukan pemeriksaan mikroskopik dari serbuk simplisia maka dilakukan pemeriksaan mikroskopik pada tanaman segar.
- Sayatan melintang daun tumbuhan patikan kebo
Cara kerja: Pada kaca objek ditetesi kloralhidrat, diletakkan sayatan melintang daun tumbuhan patikan kebo, dipanaskan diatas lampu spiritus, tidak sampai kering, dicuci dengan beberapa tetes akuades, kemudian ditetesi beberapa tetes floroglusinol HCl, didiamkan selama 10 menit, ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dibawah mikroskop.
- Sayatan membujur (atas dan bawah) daun tumbuhan patikan kebo
Cara kerja: Pada kaca objek ditetesi kloralhidrat, diletakkan sayatan membujur daun tumbuhan patikan kebo, dipanaskan diatas lampu spiritus, tidak sampai kering, dicuci dengan beberapa tetes akuades, ditambah kloralhidrat, ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dibawah mikroskop. Hasil mikroskopik sayatan melintang dan membujur daun tumbuhan patikan kebo dapat dilihat padalampiran 4 halaman 43-45. - Pemeriksaan serbuk simplisia
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia herba patikan kebo. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi larutan kloral hidrat kemudian ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati pada mikroskop. Hasil mikroskopik serbuk simplisia herba patikan kebo dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 46.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (Destilasi Toluen). Alat-alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung penerima.
Cara kerja : kedalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam, toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air dalam tabung penerima dibaca. Kemudian kedalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes tiap detik sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen, destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1992).
3.5.4 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian ditarakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600° C selama 2 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.5.5 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan diudara (Depkes RI, 1995).
3.5.6 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter) dalam labu bersumbat sambil dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, dan sisa dipanaskan pada suhu 105° C hingga bobot tetap. Persen kadar sari yang larut dalam air, dihitung terhadap bahan dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.5.7 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalan Etanol
Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu tersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring cepat untuk menghindari penguapan etanol, uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan panaskan sisa pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Dihitung kadar sari yang larut dalam etanol terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dari serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloida, steroida/ triterpenoida, tanin, saponin, flavonoida, glikosida dan glikosida antrakuinon
.
3.6.1Pemeriksaan Alkaloida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, kemudian ditambah 1 ml asamklorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit. Dinginkan dan disaring. Filtrat digunakan untuk percobaan berikut :
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam.
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk warna merah atau jingga.
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari ketiga percobaan diatas (Depkes RI, 1995).
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1996).
3.6.3 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, dimasukkan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik.
dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.6.4 Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 96 % dengan air (7:3), dan 10 ml asam sulfat 2 N. Direfluks selama 1 jam, didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml Timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok dan didiamkan selama 5 menit, disaring. Disari filtrat 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran kloroform-isopropanol (3:2). Pada kumpulan sari di tambahkan Natrium sulfat anhidrat, disaring dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50oC. Dilarutkan sisa dengan 2 ml etanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan diatas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molisch. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin ungu pada batas kedua cairan menunujukkan adanya gula, dengan demikian menunjukkan adanya glikosida (Depkes RI, 1995).
3.6.5 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, disari dengan 10 ml air suling lalu dipanaskan, disaring. Filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1 %. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman, menunjukkan adanya tannin (Depkes RI, 1995).
3.6.6 Pemeriksaan Steroida dan triterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan di cawan penguap. Sisanya ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann-Bourchard). Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya steroida/triterpenoida (Harborne, 1987).
3.6.7 Pemeriksaan Glikosida Antrakuinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan ini berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakuinon (Depkes RI, 1995). Hasil skrining fitokimia serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 6 halaman 52.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara perkolasi menggunakan pelarut etanol.
Cara kerja :
Sebanyak 300 g serbuk simplisia dibasahi dengan cairan penyari dan dibiarkan selama 3 jam, kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator. Lalu dituang cairan penyari secukupnya sampai semua terendam dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir. Perkolasi dihentikan setelah tetesan perkolat terakhir tidak bereaksi lagi dengan pereaksi untuk uji senyawa golongan flavonoida. Selanjutnya ekstrak diuapkan dengan penguap vakum putar pada temperatur tidak lebih dari 50°C sampai diperoleh ekstrak kental. Kemudian dikeringkan dengan freeze dryer selama lebih kurang 24 jam Bagan ekstraksi serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 7 halaman 53.
3.8 Ekstraksi Cair-Cair Senyawa Flavonoida
Ekstraksi cair-cair senyawa flavonoida dari ekstrak etanol dilakukan berturut-turut dengan pelarut n-heksana, kloroform dan etil asetat. Caranya : ekstrak etanol ditambah 10 ml etanol, kemudian dilarutkan dalam air panas sebanyak 100 ml, selanjutnya dihidrolisis dengan asam (ditambah asam klorida 2N), di refluks selama 5 jam dan dimasukkan kedalam corong pisah, mula-mula difraksinasi dengan n-heksana
sebanyak 100 ml, diperoleh fraksi n-heksana dan fraksi air. Fraksi n-heksana dipisahkan, fraksi air kemudian difraksinasi lagi dengan kloroform sebanyak 100 ml, diperoleh fraksi kloroform dan fraksi air, kemudian fraksi kloroform dipisahkan fraksi air difraksinasi lagi dengan 100 ml etil asetat, diperoleh fraksi etil asetat dan fraksi air. Ekstrak hasil fraksinasi dipekatkan dengan diuapkan diatas penangas air (Markham, 1988). Bagan ekstraksi cair-cair dari ekstrak etanol dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 54.
3.9 Analisis Senyawa Flavonoida dari Ekstrak Hasil Fraksinasi Dengan Cara Kromatografi Kertas
Terhadap ekstrak hasil fraksinasi dilakukan kromatografi kertas (KKt) dengan fase gerak asam asetat 50 % , BAA (n-butanol - asam asetat - air = 4:1:5) dan forestal (asam asetat - air - asam klorida), asam asetat 15%, HCl 1% Fase diam adalah kertas whatman No.1 yang berukuran 3x25 cm.
Cara kerja :
Ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air masing-masing ditotolkan pada kertas whatman dari tepi bawah, kemudian kertas tersebut dimasukkan kedalam chamber yang berisi fase gerak yang telah dijenuhkan, lalu dielusi dengan jarak rambat 20 cm. Kertas diangkat dan dikeringkan. Hasil disemprot dengan pereaksi AlCl3 5% dalam etanol dan diamati dibawah lampu ultraviolet. Hasil kromatogram dengan KKt dari ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat,fraksi air dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 56-65.
3.10Pemisahan Senyawa Flavonoida Dari Fraksi Etil Asetat Dengan Cara Kromatografi Kertas Preparatif
Terhadap fraksi etil asetat dilakukan pemisahan secara kromatografi kertas preparatif (KKt preparatif) dengan fase gerak asam asetat 50 % dan fase diam kertas whatman No.3 dengan ukuran 15 x 15 cm.
Cara kerja :
Fraksi etil asetat yang telah diencerkan ditotolkan pada kertas berupa pita, kemudian dimasukkan kedalam chamber berisi fase gerak yang telah dijenuhkan. Lalu dielusi dengan jarak 20 cm, kertas diangkat, dan dikeringkan, diamati diabawah sinar ultraviolet. Bercak diberi tanda dan digunting menjadi potongan kecil-kecil, direndam dalam metanol selama 24 jam dan sekali-kali dikocok lalu disaring. Selanjutnya filtrat dikumpulkan dan dipekatkan hingga diperoleh isolat kental. Isoalat kental yang diperoleh dari hasil KKt preparatif dilakukan KKt kualitatif. Hasil kromatogram dengan KKt preparatif dari fraksi etil asetat dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 66.
3.11Uji Kermunian terhadap Senyawa Flavonoida Hasil Kromatografi Kertas Preparatif
Uji kemurnian terhadap isolat hasil isolasi dilakukan dengan cara:
1. Kromatografi kertas menggunakan berbagai fase gerak, yaitu: asam asetat 50%, BAW (n-butanol - asam asetat - air = 4 : 1 : 5), asam asetat 15 %, HCl 1% dengan penampak bercak aluminium klorida 5% b/v.
Cara kerja:
Isolat ditotolkan pada kertas Whatman No. 1 berukuran 3x25 cm, kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan uap fase gerak dan dielusi dengan jarak rambat 20 cm. Selanjutnya kertas dikeluarkan dan dikeringkan. Hasilnya dilihat di bawahsinar lampu UV 366 nm dan dideteksi dengan penampak bercak aluminium klorida 5% b/v, dan dilihat kembali dibawah sinar UV 366 nm.
2. Kromatografi kertas dua arah dengan memakai dua sistem fase gerak, fase gerak I adalah BAW (n-butanol - asam asetat - air = 4 : 1 : 5) dan fase gerak II adalah asam asetat 50% v/v.
Isolat ditotolkan pada kertas Whatman No. 3, kemudian dimasukkan kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan uap fase gerak pertama, lalu dielusi dengan jarak rambat 15 cm. Kertas dikeluarkan dan dikeringkan selanjutnya dielusi kembali dengan fase gerak kedua, kemudian kertas dikeluarkan dan dikeringkan. Hasilnya dilihat di bawah sinar lampu UV 366 nm dan dideteksi dengan penampak bercak aluminium klorida 5% dan dilihat kembali di bawah sinar lampu UV 366 nm. Hasil kromatogram dengan KKt kualitatif isolat serta hasil kromatogram dengan KKt dua arah dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 67-77.
3.12Karakterisasi Hasil Isolasi
Karakterisasi senyawa hasil isolasi dilakukan dengan spektrofotometri ultraviolet.
3.12.1 Karakterisasi Isolat dengan Spektrofotometri Ultraviolet dengan Penambahan Pereaksi Geser (Shift reagent)
1. Isolat dilarutkan dalam metanol, dimasukkan ke dalam kuvet dan kemudian diukur absobansinya pada panjang gelombang 210-500 nm. Setelah diukur spektrumnya dalam metanol, ditambahkan tiga tetes larutan NaOH 2 N ke dalam kuvet dan direkam spektrumnya, kemudian direkam kembali setelah 5 menit.
2. Larutan isolat ditambahkan enam tetes pereaksi AlCl3, dikocok dan diukur spektrumnya, selanjutnya ditambahkan tiga tetes HCl dan diukur spektrumnya.
3. Larutan isolat ditambahkan serbuk natrium asetat hingga kira-kira 2 mm lapisan natrium asetat pada dasar kuvet dikocok dan diukur spektrumnya.Spektrum natrium asetat diukur kembali setelah 5 menit. Ke dalam kuvet ditambahkan serbuk asam borat anhidrat kira-kira setengah
dari serbuk natrium asetat dan dicampur, lalu diukur spektrum natrium asetat/asam borat.
Spektrum dari isolat hasil isolasi dengan spektrofotometri UV
menggunakan pereaksi geser (shift reagen) dapat dilihat pada lampiran 11 halaman 78-84.
BAB IV