Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Biologi Tanah Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara. Pengambilan sampel akar tanaman dan tanah dilakukan di desa Ria-ria, Kecamatan Sipoholon, Kabupaten Tapanuli Utara. Secara geografis terletak pada koordinat antara 98° 54’ 00’’ - 99° 01’ 30” BT dan 1° 56’ 30” – 2° 06’ 00” LS. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Januari sampai dengan April 2007.
Bahan Dan Alat
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan untuk prosedur teknik tuang saring dan teknik sentrifugasi adalah sampel tanah, glukosa 60%, larutan pewarna Melzer’s reagent, dan larutan PVLG. Sedangkan untuk kolonisasi CMA bahan yang digunakan adalah KOH 2,5%, HCL 2%, larutan staining (Trypan blue) 0,05%, larutan destaining (lacto glycerol), kutex (nail polish).
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: kamera, kompas, tali, meteran, sekop, kantong plastik, kertas label, cangkul, parang, saringan test sieve
710µ m; 215 µ m; 50 µ m, tabung sentrifuge, pipet tetes, cawan Petri, mikroskop binokuler dan mikroskop compound, pinset spora, tabung reaksi, kaca preparat, gelas penutup dan stereoskop.
Metode Penelitian
Tehnik pengambilan sampel tanah dan tanaman dilakukan dengan membuat petak pengamatan yang berukuran ± 20 m x 20 m (sesuai dengan keadaan di lapangan). Dalam penelitian ini ada tiga jenis vegetasi yang akan diambil contoh tanah dan tanamannya yaitu vegetasi alang-alang, umbi-umbian dan sayur-sayuran. Setiap satu jenis vegetasi dibuat tiga petak pengamatan dimana petak pengamatan ini bebas diletakkan dimana-mana dengan asumsi bahwa vegetasinya sama. Sehingga jumlah petak pengamatan yang akan dibuat berjumlah 9. Pada masing-masing petak diambil contoh tanah dari zona rhizosfer pada kedalaman 0-20 cm dan contoh tanaman sebanyak tiga tanaman dari setiap petak. Pengambilan contoh tanah dilakukan secara komposit dengan membuat lima titik atau pembuatan titik secara zig-zag pada setiap petak dan diambil contoh tanah dari tiap titik kira-kira 1 kg. Sehingga dalam satu petak ada sebanyak 5 kg tanah kemudian tanah yang dari 5 titik tadi dicampur dan diambil 1 kg untuk dijadikan sebagai sampel tanah yang akan diteliti.
Pelaksanaan Penelitian
Ekstraksi Spora dan Identifikasi Cendawan Mikoriza Arbuskula. Ekstraksi spora CMA dilakukan untuk memisahkan spora CMA dari sampel tanah sehingga dapat dilakukan identifikasi guna mengetahui jumlah dan genus spora CMA yang terdapat pada setiap petak contoh. Teknik yang digunakan dalam mengekstraksi spora CMA adalah teknik tuang-saring dan dilanjutkan dengan teknik sentrifugasi dari Brundett et al. (1996).
Prosedur teknik tuang saring dan teknik sentrifugasi secara lengkap adalah sebagai berikut :
1. 10 gram tanah sampel dituangkan dalam gelas piala, ditambahkan air 500 ml dan diaduk, dibiarkan selama 30 menit agar partikel-partikel besar mengendap.
2. Campuran tanah sampel dengan air tersebut disaring dalam satu set saringan dengan ukuran 710µ m; 215 µ m; 50 µ m secara berurutan dari atas kebawah. Partikel yang tertahan dalam saringan yang paling bawah tersebut dicuci dengan air mengalir, dan dipindahkan ke dalam tabung
sentrifuge.
3. Ke dalam tabung sentrifuge ditambahkan larutan glukosa 60%.
4. Tabung sentrifuge ditutup rapat dan disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit, sehingga spora cendawan akan mengapung dan tanah akan mengendap dibawah.
5. Cairan yang bening dalam tabung sentrifuge dituang ke dalam saringan 50µ m, dan dicuci dengan air mengalir dan dipindahkan ke cawan petri dan kemudian diperiksa di bawah mikroskop binokuler.
6. Selanjutnya spora-spora yang diperoleh dipisahkan ke dalam gelas arloji dengan menggunakan pinset spora.
7. Identifikasi jenis spora dilakukan melalui pengamatan preparat spora dengan pewarnaan Melzer’s reagent.
Kolonisasi CMA pada Akar Tanaman Sampel
Kolonisasi akar ditandai dengan adanya hifa, vesikula dan arbuskula atau salah satu dari ketiganya. Setiap bidang pandang (field of view) mikroskop yang menunjukkan tanda kolonisasi diberi symbol (+) dan yang tidak diberi tanda (-). Pengamatan kolonisasi CMA pada akar tanaman sampel dapat dilakukan melalui teknik pewarnaan akar (staining akar), karena karakteristik anatomi yang mencirikan ada tidaknya infeksi CMA tidak dapat dilihat secara langsung. Metode yang digunakan dalam pewarnaan akar sampel adalah metode pewarnaan dari Kormanik dan Mc.Graw (1982) dalam Delvian (2003), yang secara lengkap adalah sebagai berikut:
1. Dipilih akar-akar segar dan dicuci dengan air mengalir sampai bersih, sampel akar direndam dalam larutan KOH 10 % selama 12 jam.
2. Larutan KOH kemudian dibuang dan akar dicuci pada air mengalir selama 5-10 menit.
3. Sampel akar direndam dalam larutan HCL 2 % selama 24 jam dan pada proses ini akar akan berwarna pucat atau putih. Larutan HCL 2 % kemudian dibuang dengan mengalirkannya secara perlahan-lahan.
4. Selanjutnya akar sampel direndam dalam larutan staining (Trypan blue
0.05 %) selama 24 jam untuk proses pewarnaan akar.
5. Larutan trypan blue 0.05 % kemudian dibuang dan diganti dengan larutan
lacto glycerol untuk proses destaining atau pengurangan warna.
6. Secara acak diambil potong-potongan akar yang telah diwarnai dengan panjang ± 1 cm sebanyak 10 potongan akar dan disusun pada kaca preparat.
7. Diletakkan kaca penutup (cover glass) diatas potongan akar kenudian dengan menggunakan ujung lidi yang tumpul ditekan potongan akar secara perlahan-lahan sehingga potongan akar menjadi lembaran tipis.
8. Sehingga kegiatan pengamatan siap dilakukan.
9. Perhitungan persentase kolonisasi akar menggunakan metode panjang
slide dari Giovanetti dan Mosse (1980) dalam Delvian (2003). Secara acak diambil potongan-potongan akar yang telah diwarnai dengan panjang ± 1 cm sebanyak 10 potongan akar dan disusun pada preparat slide. Persentase kolonisasi akar dihitung dengan menggunakan rumus:
% Kolonisasi =
∑∑
− + + ) ( & ) ( tan _ _ ) ( tan _ _ da ber pandang bidang da ber pandang bidang x 100% Keterangan :Bidang pandang bertanda (+) = Setiap bidang pandang yang menunjukkan adanya kolonisasi yang ditandai dengan adanya hifa, vesikula ataupun arbuskula. Bidang pandang bertanda (-) = Setiap bidang pandang yang tidak menunjukkan
adanya kolonisasi.
Penentuan status mikoriza didasarkan pada tabel menurut Setiadi et al, (1992) sebagai berikut: Nilai Keterangan 0-25 26-50 51-75 76-100 Rendah Sedang Tinggi Sangat Tinggi